GP73基因转染树突状细胞瘤苗的制备及对肝癌免疫治疗的实验研究

摘要

第一部分、GP73-DNA瘤苗的构建及表达研究
　　目的:构建GP73-cDNA慢病毒表达载体，并体外感染树突状细胞(DC2.4)，制备GP73-DC疫苗，同时用携带GP73基因的慢病毒转染小鼠Hepa1-6肝癌细胞为进一步研究该疫苗的免疫治疗作用奠定基础。
　　方法:将人GP73基因克隆到慢病毒GV358载体，通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆。将鉴定后的重组表达质粒GV358-GP73与pHelpe r1.0质粒和pHelper2.0质粒共转染293T细胞，制备携带GP73基因的慢病毒LentivirusGP73。应用LentivirusGP73感染体外培养的DC2.4细胞和Hepa1-6肝癌细胞，Western Blot检测感染后的DC2.4细胞和Hepa1-6细胞中GP73蛋白表达。
　　结果:构建的慢病毒载体GV358-GP73经PCR鉴定和测序正确，包装慢病毒LentivirusGP73滴度为2×108TU/mL。慢病毒Lentivirus-GP73感染DC2.4细胞和Hepa1-6细胞后GP73表达明显增加。
　　结论:成功构建了携带人GP73基因的慢病毒表达载体，慢病毒Lent ivirusGP73能高效感染DC2.4细胞和Hepa1-6细胞，并且成功表达GP73蛋白。
　　第二部分、GP73-DNA瘤苗诱导CTL特异性杀伤肝癌细胞的研究
　　目的:GP73-DC2.4细胞诱导培养淋巴细胞，观察其对Hepa1-6肝癌细胞的杀伤效应。
　　方法:从小鼠的脾脏中提取T淋巴细胞，分三组与DC2.4细胞进行共培养诱导T淋巴细胞，分别为GP73-DC2.4组，阴性病毒-DC2.4组，未转染DC2.4组;将每组诱导产生CTLs和未经诱导的T淋巴细胞分别与转染和未转染的Hepa1-6细胞共培养。CCK8法检测T淋巴细胞的增殖效应，CytoTox96(R)非放射性细胞毒性检测法检测CTLs细胞对Hepa1-6肝癌细胞的杀伤效应。
　　结果:成功诱导了T淋巴细胞的增殖，增殖率为67％。GP73-DC2.4疫苗诱导产生的CTLs对Hepa1-6细胞具有杀伤作用，GP73-DC2.4组对GP73-Hepa1-6细胞的杀伤效应明显高于未转染的Hepa1-6组、阴性对照病毒负载组及未处理DC2.4组(P＜0.05)。
　　结论:以GP73-DC2.4疫苗诱导产生的CTLs细胞对小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞具有更显著的杀伤效应。
　　第三部分、GP73-DNA瘤苗体内抗肿瘤研究
　　目的:建立C57BL/6J小鼠肝癌成瘤模型，观察GP73-DC2.4疫苗对成瘤小鼠体内免疫治疗HCC的作用。
　　方法:40只C57BL/6J小鼠右腋皮下接种小鼠肝癌细胞系Hepa1-6，建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型，随机分成4组，每组10只，雌雄各半。分别为PBS组，GP73-DC2.4组，阴性病毒-DC2.4组，未转染DC2.4组。于造模后肿瘤大小长至20mm后，第0天开始，以后每7天给予DC疫苗瘤内注射，每两天称量体重一次。第21天处死小鼠取出瘤组织。瘤组织测量大小并计算抑瘤率;
　　结果:在给小鼠接种Hepa1-6细胞第6天后开始生长，在第12天的时候长至20mm，注射疫苗后第7天开始出现实验组肿瘤大小明显变小;GP73-DC2.4组抑瘤率为65.03％，阴性病毒-DC2.4组抑瘤率为55.42％，未转染DC2.4组抑瘤率为40.37％，与PBS组比较差异有统计学意义(P＜0.05);
　　结论:成功构建小鼠肝癌成瘤模型，GP73-DC2.4疫苗对HCC的体内免疫治疗有效。

目录

声明

个人简历

中英文缩略词表

摘要

第一部分 GP73-DC2．4瘤苗的构建及表达研究

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第二部分 GP73-DC2．4瘤苗体外诱导CTLs特异性杀伤肝癌细胞的实验研究

1 材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第三部分 GP73-DNA瘤苗体内抗肿瘤实验研究

1．材料与方法

2．结果

3 讨论

参考文献

全文小结

综述 慢病毒、树突状细胞疫苗在肿瘤治疗的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文