缓释CGRP的壳聚糖涂层掺锶磷酸钙骨水泥体外对HUVECs增殖的影响

摘要

目的:研究缓释降钙素基因相关肽（CGRP）的壳聚糖涂层掺锶磷酸钙骨水泥（CGRP/Chitosan-Sr-CPC）的合成方法、形态结构、力学性能、释放规律，及其对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖的影响。
　　方法:(1)材料分组与制备:实验分3组，CGRP/Chitosan-Sr-CPC为实验组，掺锶磷酸钙骨水泥(Sr-CPC)（锶和钙的摩尔比是1∶9）、壳聚糖涂层掺锶磷酸钙骨水泥(Chitosan-Sr-CPC)为对照组。根据文献方法制备Sr-CPC[1-2]，Sr-CPC作为多孔基体，采用加压渗透和冷冻干燥法，吸附CGRP进入孔隙内，然后再采用加压渗透和冷冻干燥法，表面吸附壳聚糖(Chitosan)涂层，合成CGRP/Chitosan-Sr-CPC和Chitosan-Sr-CPC（未吸附CGRP）。(2)材料表征:扫描电镜(SEM)、微计算机断层扫描（micro-CT）、电子动静态万能材料试验机观察分析材料的表面结构、孔隙和力学性能，ELISA试剂盒检测探究模拟体液(SBF)中材料CGRP的释放规律。(3)细胞实验:免疫荧光法(IF)检测观察原代人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表面CGRP受体表达的情况，骨架染色观察材料表面的细胞粘附形态，CCK8法评估材料细胞毒性和刺激增殖能力， ELISA试剂盒检测细胞分泌内皮细胞生长因子(VEGF)的水平。
　　结果:成功合成CGRP/Chitosan-Sr-CPC。材料表征:SEM镜下观察其表面均匀铺展一层Chitosan涂层，在SBF中第7天仍然存在。其中Sr-CPC基体在SBF中表面逐渐生成花丛样、针尖样物质（根据以往实验和文献资料，该物质为羟基磷灰石晶体）[1-2]。micro-CT检测孔隙率为(4.06±1.19)％，孔径多分布于45-82μm区间。与Sr-CPC相比，早期无明显抗压强度损失，且随时间逐步增加。ELISA试剂盒检测结果显示CGRP可持续释放至第5天，释放速率随时间逐渐减慢。细胞实验:IF镜下观察HUVECs表达CGRP受体。从骨架染色图片可看出细胞在材料表面良好粘附。CCK8实验结果说明，各组材料溶出物无细胞毒性，实验组细胞增殖率明显高于对照组(P＜0.05)。ELISA试剂盒检测第2天培养液中细胞分泌VEGF水平，实验组较对照组明显升高(P＜0.05)。
　　结论:通过上述实验方法合成的CGRP/Chitosan-Sr-CPC复合骨水泥，生物相容性良好，结构性能与Sr-CPC相比无明显差异，同时体外早期可以持续释放微量活性CGRP神经肽，与细胞CGRP受体特异性结合，可能通过上调内皮细胞表达和分泌VEGF，进而刺激内皮细胞增殖。期望其在血供环境差的骨损伤（如老年性骨质疏松性骨缺损）修复中，通过早期持续释放微量活性CGRP神经肽，改善骨水泥与组织交互界面的神经营养环境，刺激内皮细胞增殖和血管生成，构建良好微循环，增强Sr-CPC的骨整合、骨诱导能力，拓展应用范围。

目录

声明

摘要

前言

1．材料和方法

1．1 材料

1．2 分组与制备

1．3 形态结构

1．4 力学性能

1．5 CGRP释放

1．6 细胞实验

1．7 统计学处理

2 结果

2．1 表面形态和孔隙分析

2．2 抗压性能

2．3 CGRP释放规律

2．4 细胞实验结果

2．4．1 细胞CGRP受体表达

2．4．2 材料细胞毒性评价

2．4．3 材料表面细胞粘附状况

2．4．4 材料表面细胞增殖情况

2．4．5 细胞分泌VEGF水平

3．讨论

参考文献

降钙素相关基因肽在骨质疏松性骨折愈合过程中的作用及研究进展

附录

致谢

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