二甲双胍联合葡萄糖代谢抑制对肝癌细胞增殖和凋亡的研究

摘要

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症死亡病因第二位，严重危害人们的健康。其恶性程度高，治疗效果差，病死率较高。肝癌患者5年预后生存率小于15％，缺乏有效的治疗药物，因此，探索其发生发展过程中的特异性机制，有针对性的预防和诊断治疗，对肝癌防治有着重要的意义。
　　肿瘤细胞发生发展过程中需要大量葡萄糖，即使在无氧条件下，恶性肿瘤细胞更倾向于无氧糖酵解的途径来获取能量，这便是著名的瓦博格效应。因此，葡萄糖是大多数恶性肿瘤的能量来源。目前低糖治疗已经作为一种新的肿瘤治疗方式被运用到临床。靶向能量代谢是抗癌治疗的一个新的方向。
　　二甲双胍是常用的一种降糖药。近年研究发现，二甲双胍具有一定的抗肿瘤作用，减少糖尿病患者罹患恶性肿瘤的风险，增强药物的疗效。有研究报道，二甲双胍一方面能够减少肝脏糖异生和血液中葡萄糖的释放，限制了肝脏的缓冲功能，并在营养素摄入减少期间加大了血清葡萄糖的降低水平;另一方面，二甲双胍已被证明是通过直接抑制可能由短期葡萄糖缺乏引起的能量补充消耗的线粒体呼吸复合物Ⅰ，阻碍癌症细胞的生长。2-脱氧-D-葡萄糖，是一种葡萄糖类似物，能够阻断葡萄糖代谢，损耗肿瘤细胞的能力供给。有研究报道，2-脱氧-D-葡萄糖能增加氧化应激，抑制糖基化，并诱导细胞自噬。也可以有效地延缓细胞生长，有效促进特定的肿瘤细胞的凋亡。虽然2-脱氧-D-葡萄糖本身在许多类型的癌症的治疗作用有限，它可以结合其他治疗药物或放射治疗具有协同抗肿瘤作用。
　　细胞自噬是依赖溶酶体途径对胞质和细胞器进行降解的一种过程，在进化上具有高度保守性，其在细胞死亡，细胞存活，衰老和代谢的生理和病理过程起着重要的作用。更重要的是，自噬是一个关键的促进细胞存活的应激机制。PI3K/AKT/mTOR信号通路具有调节自噬的作用。AKT磷酸化是该通路上的一个的重要环节，对肿瘤细胞存活和凋亡有着重要的作用。本论文通过研究二甲双胍联合葡萄糖缺乏对肝癌细胞的增殖情况，继而用2-脱氧-D-葡萄糖代替葡萄糖缺乏，联合二甲双胍对肝癌细胞增殖和凋亡的作用，并进一步探讨促凋亡的机制，以期为预防和治疗肝癌患者提供新的靶点方向。
　　第一章二甲双胍联合葡萄糖缺乏对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
　　目的:探索二甲双胍联合葡萄糖缺乏对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
　　方法:
　　1.用全培养液、无血清培养液以及无葡萄糖培养液培养肝癌HepG2、Hep3B、HCCM、Huh7和PLC/5细胞，利用Wst-1试剂观察肝癌细胞不同时间段的增殖情况。
　　2.利用流式细胞术检测全培养液、谷氨酰胺和葡萄糖双缺乏培养液、葡萄糖补充培养液、谷氨酰胺补充培养液以及两者均补充培养液培养肝癌细胞48h后的subG1凋亡率。
　　3.把二甲双胍加入到培养液中。实验分成四组，全培养液组，二甲双胍全培养液组、无葡萄糖培养液组和二甲双胍无葡萄糖培养液组，培养肝癌Huh7和HepG2细胞，分别在24h和48h后观察细胞的形态学改变，然后利用流式细胞术的方法，检测肝癌细胞的存活情况。
　　4.运用蛋白免疫印迹技术分析全培养液组、二甲双胍全培养液组、无葡萄糖培养液组和二甲双胍无葡萄糖培养液组培养的肝癌Huh7细胞的PARP、Caspase-3、Mcl-1、LC3及p-AKT等相关蛋白的变化。
　　结果:
　　1.无葡萄糖培养液培养的肝癌细胞相比较全培养液和无血清培养液的培养的肝癌细胞，增殖率随着时间逐渐下降，其中肝癌HepG2、HCCM细胞变化最明显。
　　2.葡萄糖和谷氨酰胺双缺乏培养液和谷氨酰胺补充培养液培养的肝癌HepG2细胞subG1凋亡率分别为（94.00±0.50）％和(74.80±1.92)％，与全培养液培养的肝癌HepG2细胞subG1凋亡率(4.40±0.21)％、葡萄糖补充培养液（11.00±0.21）％和两者均补充培养液（7.20±0.29）％相比较，差异具有统计学意义;而五组培养液培养的肝癌Hep3B、Huh7和PLC/5细胞的subG1凋亡率差异没有统计学意义。
　　3.显微镜下二甲双胍无葡萄糖培养液组培养的肝癌Huh7细胞48h后数量明显减少，密度降低。
　　4.二甲双胍无葡萄糖培养液组的死亡率为（74.97±0.21）％，与无葡萄糖培养液组（32.69±0.89）％、二甲双胍全培养液组（11.98±0.29）％及全培养液组（7.74±0.23）％比较，差异具有统计学意义;无葡萄糖培养液组的死亡率为（32.69±0.89）％，与二甲双胍全培养液组（11.98±0.29）％及全培养液组（7.74±0.23）％比较，差异具有统计学意义。
　　5.蛋白免疫印迹技术显示，二甲双胍无葡萄糖培养液组可以观察到明显的Caspase-3激活、PARP切割，Mcl-1表达的降低，以及AKT的磷酸化，自噬相关蛋白LC3B的减少。
　　结论:
　　1.葡萄糖缺乏能够抑制肝癌HepG2、HCCM细胞的增殖，促进细胞的凋亡。
　　2.肝癌HepG2、HCCM细胞的存活对葡萄糖缺乏比较敏感，而肝癌Hep3B、Huh7和PLC/5细胞比较耐受。
　　3.二甲双胍能促进在葡萄糖缺乏条件下肝癌Huh7细胞的凋亡。
　　4.二甲双胍能促进在葡萄糖缺乏条件下肝癌Huh7细胞的凋亡可能与AKT磷酸化和自噬有关。
　　第二章二甲双胍联合2-脱氧-D-葡萄糖对肝癌细胞的增殖和凋亡的影响
　　目的:探讨二甲双胍联合葡萄糖拮抗剂2-脱氧-D-葡萄糖对肝癌细胞的增殖和凋亡的影响及其凋亡相关蛋白的改变。
　　方法:
　　1.不同浓度二甲双胍全培养液和2-脱氧-D-葡萄糖全培养液培养肝癌细胞，48h后利用Wst-1试剂观察肝癌细胞的增殖情况。
　　2.二甲双胍和2-脱氧-D-葡萄糖单独及联合培养肝癌Hep3B、HepG2细胞，48h后利用Wst-1试剂观察肝癌细胞的增殖情况。
　　3.显微镜下观察二甲双胍和2-脱氧-D-葡萄糖单独及联合作用肝癌HepG2、Hep3B细胞的形态学改变。
　　4.利用流式细胞术检测全培养液组、二甲双胍全培养液组、2-脱氧-D-葡萄糖培养液组、二甲双胍联合2-脱氧-D-葡萄糖组培养肝癌HepG2和Hep3B细胞48h后的subG1死亡率。
　　5.运用蛋白免疫印迹技术分析二甲双胍单独及联合2-脱氧-D-葡萄糖培养肝癌HepG2细胞PARP、Caspase-3及Mcl-1相关凋亡蛋白的改变。
　　结果:
　　1.随着二甲双胍和2-脱氧-D-葡萄糖的浓度上升，肝癌细胞HepG2、HCCM、Hep3B及PLC/5的增殖率下降，呈剂量-反应关系。
　　2.二甲双胍联合2-脱氧-D-葡萄糖组培养的肝癌HepG2细胞的存活率为（22.48±0.51）％，与二甲双胍培养液组（80.68±5.10）％、2-脱氧-D-葡萄糖组（72.56±4.34）％以及对照组（100.00±5.05）％比较，差异具有统计学意义;二甲双胍联合2-脱氧-D-葡萄糖组培养的肝癌Hep3B细胞的增殖率(29.16±1.34)％，与二甲双胍培养液组（59.58±1.92）％和对照组（100.00±1.23）％比较，差异具有统计学意义，与2-脱氧-D-葡萄糖培养液组（33.87±1.95）％比较，差异不具有统计学意义。
　　3.二甲双胍和2-脱氧-D-葡萄糖联合处理使得HepG2细胞数量明显减少，细胞皱缩、脱落;而联合组虽然也造成Hep3B、Huh7细胞密度降低，但并未显著增加脱落的死细胞。
　　4.二甲双胍联合2-脱氧-D-葡萄糖组培养的肝癌HepG2细胞的subG1凋亡率（39.63±0.21）％，明显高于对照组（7.12±0.14）％、二甲双胍组（12.56±0.35）％和2-脱氧-D-葡萄糖组（15.16±1.93）％，差异有统计学意义; Hep3B细胞联合组的凋亡率为(12.58±1.03)％，与对照组（2.82±0.51）％和二甲双胍组（8.98±0.86）％比较，差异具有统计学意义，与2-脱氧-D-葡萄糖组（12.40±1.78）％比较，差异不具有统计学意义。
　　5.蛋白免疫印迹技术显示，联合组可以观察到明显的Caspase-3激活、PARP切割，以及Mcl-1表达的降低。
　　结论:
　　1.二甲双胍联合2-脱氧-D-葡萄糖能进一步诱导肝癌HepG2、HCCM细胞的凋亡;而联合用药对肝癌Hep3B细胞无明显诱导凋亡作用。
　　2.二甲双胍和2-脱氧-D-葡萄糖联合对于肝癌HepG2细胞的凋亡作用可能通过激活Caspase-3有关，并且可能与抗凋亡蛋白Mcl-1的减弱有关。

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个人简历

主要缩略语

摘要

第一章 二甲双胍联合葡萄糖缺乏对肝癌细胞的增殖和凋亡的影响

前言

1 材料与方法

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第二章 二甲双胍联合葡萄糖拮抗剂2-脱氧-D-葡萄糖对肝癌细胞的增殖和凋亡的影响

前言

1 材料与方法

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

全文总结

综述 葡萄糖代谢对肿瘤细胞的影响及研究进展

致谢

攻读硕士学位期间已发表和待发表的学术论文