肿瘤相关巨噬细胞--肝癌细胞三维共培养体系中分泌蛋白的差异及CXCL2在肝癌转移中的作用

摘要

第一部分、肿瘤相关巨噬细胞的诱导、鉴定及其对肝癌细胞的影响
　　肝癌是经典的炎症相关性肿瘤，肝癌细胞所在微环境内浸润着大量肿瘤相关巨噬细胞，并以M2型肿瘤相关巨噬细胞为主。本部分研究旨在通过体外诱导获得不同活化状态巨噬细胞并明确其对肝癌细胞生物学行为的影响。我们首先通过人单核白血病细胞THP-1经佛波酯诱导为未分化巨噬细胞(UMO)，再分别经脂多糖，白介素4和13诱导获得经典活化的巨噬细胞M1及选择性激活的巨噬细胞M2;然后通过形态学、荧光定量PCR和ELISA对其表型进行鉴定;最后从增殖、迁移及侵袭实验探索不同活化状态巨噬细胞条件培养基(conditioned medium，CM)对肝癌细胞生物学行为的影响，并检测了肝癌细胞中上皮-间质化转换(EMT)标志物的变化。
　　结果显示:(1)与UMO相比，M1呈长梭形或多边形，TNF-α和CCL3 mRNA的表达量及IL-12的分泌均明显升高;M2伪足细长而杂乱、呈抱团式生长，AMAC-1、CCL22和Arg-1 mRNA的表达量及IL-10的分泌均显著增加。该检测结果与文献报道的结果一致，说明已成功诱导获得不同活化状态的巨噬细胞;(2)生物学功能实验显示经M2CM处理后的肝癌细胞与对照组相比，其增殖、迁移和侵袭能力均显著增强，而M1CM处理的肝癌细胞则无明显变化，说明M2型肿瘤相关巨噬细胞能显著促进肝癌细胞恶性变;(3)经M2CM处理后的肝癌细胞上皮标志物E-cadherin的表达明显下降，伴随间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin和α-SMA显著上升，经M1CM处理的肝癌细胞各标志物的表达量均无明显变化，说明仅有经M2CM处理后的肝癌细胞发生了EMT。
　　第二部分、肿瘤相关巨噬细胞和肝癌细胞三维共培养体系中分泌蛋白的差异
　　体内状态的肿瘤细胞生存于立体、复杂而开放的微环境中，分泌蛋白是该微环境中肿瘤细胞与TAMs间相互作用的重要桥梁。在本部分研究中，我们利用低熔点琼脂糖作为支架建立肿瘤相关巨噬细胞与肝癌细胞的三维立体共培养体系，通过iTRAQ标记为基础的定量蛋白质组学技术对三维培养体系中的分泌蛋白进行比较分析和筛选，并应用Western-Blot对部分差异蛋白的鉴定结果进行验证。
　　结果显示:(1)不同三维立体培养体系中的条件培养基经iTRAQ标记、质谱分析及数据库搜索，一共鉴定到了26677条肽段及1640个蛋白（99％可信度）。将鉴定到的蛋白按比值≥1.3定义为上调，比值≤0.7定义为下调的准则进行筛选，发现在与M2比较时，有333个分泌蛋白差异性表达在M2+SMMC7721共培养体系;在与SMMC7721比较时，有357个分泌蛋白差异性表达在M2+SMMC7721共培养体系;同时与M2、SMMC7721单一立体培养体系比较时，有159个分泌蛋白差异性表达在M2+SMMC7721共培养体系中，其中上调的差异性分泌蛋白为63个，下调的为96个。(2) Western-Blot的结果显示IL-8、IL-1β、HB-EGF和IGFBP3的变化趋势与质谱结果完全一致，而MMP3与CXCL2，虽发现其在M2CM中的表达高于SMMC7721CM与质谱结果相反，但两者均在共培养条件培养基中升高，该趋势与质谱结果一致。
　　第三部分、差异分泌蛋白CXCL2对肝癌细胞转移功能的影响及机制研究
　　CXCL2在本研究中被发现是共培养条件培养基里明显上升的差异蛋白，且在M2CM中的表达高于SMMC7721CM，说明其主要源于M2。其对肝癌转移能力的影响及作用机制未明。本部分通过采用不同浓度的外源性重组CXCL2蛋白刺激肝癌细胞，以观察其对肝癌细胞迁移、侵袭、粘附等生物学行为的影响，并通过信号通路芯片及通路抑制剂等方法探索其可能的作用机制。
　　结果显示:(1) CXCL2在10例肝癌患者肝癌组织中的表达比相应癌旁组织明显增高;(2)不同浓度CXCL2刺激均可显著增强肝癌细胞的迁移能力，1ng/mL刺激组的肝癌细胞侵袭能力明显增加，10ng/mL及100ng/mL CXCL2刺激组的肝癌细胞粘附能力显著降低;(3)中和共培养条件培养基中的CXCL2后其促进肝癌细胞迁移及侵袭能力的作用均明显下降;(4)通过特异性抑制剂SB225002抑制肝癌细胞表达的CXCR2后，CXCL2对肝癌细胞迁移、侵袭能力的促进作用及对其粘附能力的抑制作用均消失，说明CXCL2通过与其受体CXCR2相结合发挥作用;(5) CXCL2过表达后，通过信号通路芯片检测发现肝癌细胞中HSP27、PRAS40、bad，Chk1、IkBα(Ser32/36)的磷酸化水平均显著上调，IkBα(Total)也明显升高;Western blot的结果证实过表达CXCL2后肝癌细胞中p-IkBα的磷酸化水平明显增高，说明NF-kB通路在CXCL2过表达的肝癌细胞中被激活;(6)进一步通过NF-kB特异性抑制剂BAY117082阻断肝癌细胞的NF-kB通路，发现CXCL2促进肝癌细胞细胞迁移及侵袭的能力减弱。上述结果表明肿瘤相关巨噬细胞源性的CXCL2主要通过激活NF-kB信号通路促进肝癌细胞的迁移及侵袭。
　　结论：
　　1.在体外成功诱导获得具有典型表型特征的不同活化状态巨噬细胞M1和M2;并发现M2条件培养基可促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭并发生EMT。
　　2.成功应用低熔点琼脂糖建立肝癌细胞及M2型肿瘤相关巨噬细胞的三维立体共培养体系，通过iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术建立了不同三维立体培养体系中的分泌蛋白表达谱，并从共培养体系中鉴定到了159个差异分泌蛋白。
　　3.CXCL2是共培养体系中显著升高的蛋白，可促进肝癌细胞的迁移、侵袭能力，并抑制其粘附能力;其作用的发挥是通过与肝癌细胞表达的CXCR2受体结合，从而激活NF-kB信号通路进行。

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摘要

前言

参考文献

第一部分 肿瘤相关巨噬细胞的诱导、鉴定及其对肝癌细胞的影响

一、前言

二、材料和方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第二部分 肿瘤相关巨噬细胞和肝癌细胞三维共培养体系中分泌蛋白的差异

一、前言

二、材料和方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第三部分 差异分泌蛋白CXCL2对肝癌细胞转移功能的影响及机制研究

一、前言

二、材料和方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

全文结论

创新点

潜在应用价值

综述 构建人肝癌细胞体外三维培养模型的方法及应用

致谢

攻读学位期间发表的学术论文