将大肠杆菌外膜蛋白A信号肽改造成为抗菌肽的研究

摘要

目的：探讨将大肠杆菌外膜蛋白A(Outer membrane protein A，OmpA)信号肽改造成抗菌肽的可能性，为研究新型抗菌药物提供新的研究方向
　　方法：（一）以大肠杆菌OmpA信号肽的一级结构MKKTAIAIAVALAGFATVAQA(简称:P-AQA)为模板，对其C末端区域的氨基酸序列TVAQA其中的3个或5个氨基酸进行替换设计和合成以下3种衍生肽:(1)衍生肽1:MKKTAIAIAVALAGFARVRQK(简称:C-RQK)TVAQA中的中性氨基酸残基分别换成碱性氨基酸R和K，顺序为RVRQK;(2)衍生肽2:MKKTAIAIAVALAGFARRKKK(简称:C-KKK)，TVAQA全部替换成碱性氨基酸，顺序为RRKKK;(3)衍生肽3:MKKTAIAIAVALAGFADVDQD(简称:C-DQD)将TVAQA中的中性氨基酸残基换成酸性氨基酸D。（二）除了对C末端区域进行改造外，还在其基础上以衍生肽2(C-KKK)为模板对中间疏水区（H区）的氨基酸进行增减或替换，设计和合成以下3条多肽:(1)衍生肽4:MKKTA…VALAGFARRKKK(简称:H-IAI)将C-KKK其中H区的氨基酸AIAIAVALAGFA中的4个疏水性氨基酸IAIA去除，顺序为AVALAGFA;(2)衍生肽5:MKKTANAIAVALAGFARRKKK（简称:H-NAI）将C-KKK其中H区AIAIAVALAGFA其中的第一个疏水性氨基酸I改换成中性氨基酸N，顺序为ANAIAVALAGFA;(3)衍生肽6:MKKRTLLLLLLLLLGFARRKKK（简称:H-LLL）在C-KKK衍生多肽N末端多增加一个碱性氨基酸R的同时将（H区）AIAIAVALAGFA其中的9个疏水性氨基酸均换成疏水性氨基酸L，顺序为LLLLLLLLLGFA。（三）、除了对C末端区域及H区进行改造外，我们还在保证其N末端结构基本不变的情况下对N末端区域进行碱性氨基酸的增加，设计和合成以下衍生肽(1)衍生肽7:MKKRRKTAIAIAVALAGFATVAQA（简称:N-RRK）以P-AQA为模板在其N末端区域增加3个碱性氨基酸RRK;(2)衍生肽8:MKKRTAIAIAVALAGFARRKKK（简称:N-RTA）以衍生肽C-KKK为模板在其N末端增加一个碱性氨基酸R。（四）、为了了解保证衍生多肽结构完整性的重要性，设计合成一条全部由10个碱性氨基酸组成的衍生多肽，即衍生肽9:KKRRKKRRKK(简称P-RKK)作为对照肽;采用琼脂铺板计数法测定不同信号肽衍生肽的杀菌活性。将不同浓度梯度的9种衍生肽分别与革兰氏阳性菌(Gram-positive，G+)代表菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌(Gram-negative，G-)代表菌大肠杆菌在体系中相互作用，经37℃水浴孵育2小时后稀释铺板，在37℃恒温培养箱中培育16-18h，计数琼脂铺板上的细菌菌落数，计算不同衍生肽的杀菌活性。
　　结果：天然大肠杆菌OmpA信号肽不溶于水，无法检测其杀菌活性;①C-RQK、C-KKK对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较强的杀菌活性，浓度为200ug/ml时杀菌活性均能达到99.9％，杀菌活性为:C-KKK＞C-RQK。②P-RKK对金黄色葡萄球菌的杀菌活性均低于C-RQK及C-KKK，对大肠杆菌几乎没有杀菌活性，C-DQD对革兰氏阳性及阴性菌均无杀菌活性;四种衍生肽的杀菌活性为C-KKK＞C-RQK＞P-RKK＞C-DQD。③以C-KKK为模板改变其H区的疏水性氨基酸组成(H-LLL)对其杀菌活性几乎没有影响，去掉其中间一部份疏水性氨基酸(H-IAI)或将中间的一个疏水性氨基酸换成中性氨基酸（H-NAI）后其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌作用发生了巨大的改变，变得几乎没有杀菌活性。④以大肠杆菌OmpA信号肽为模板在其N对金黄色葡萄球菌几乎无杀菌活性而对大肠杆菌有较弱的杀菌作用，以C-KKK为模板在其N末端增加1个碱性氨基酸设计合成衍生肽N-RTA对金黄色葡萄球菌几乎没有杀菌活性，对大肠杆菌有弱杀菌活性。以C-KKK为模板在其N末端区域增加3个碱性氨基酸设计合成的衍生肽N-RRK的杀菌活性与C-KKK几乎没有差别。
　　结论：①大肠杆菌OmpA信号肽衍生肽的杀菌活性与其C末端区域的碱性氨基酸相关，且呈正相关。②H区结构在衍生肽的杀菌活性中起到至关重要的地位，缩短其疏水性氨基酸组成或将一个疏水性氨基酸改换成中性氨基酸后衍生肽的杀菌活性将大大降低甚至杀菌活性消失，而仅仅改变其疏水性氨基酸的组成对其杀菌活性没有任何影响。③改变N末端区域对信号肽衍生肽的杀菌作用影响不大。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

1 材料

2 方法

3 实验步骤

4 结果

5 讨论

6、结论与展望

参考文献

附录

综述

致谢

攻读学位期间发表论文情况