杨桃根中2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮保护棕榈酸诱导MIN6细胞功能障碍的作用及机制研究

摘要

目的:探讨杨桃根中2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-环己二酮(DMDD)抗棕榈酸(PA)诱导MIN6细胞功能障碍的作用，以及对TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的调控作用。
　　方法:MIN6细胞分为6组:正常对照组(NC组)、模型组(PA组)、阳性药组（TAK-242组）、DMDD低、中、高剂量组(DMDDL、 DMDDM、和DMDDH组)。
　　1、DMDD对MIN6细胞胰岛素水平、炎症因子水平、凋亡的影响:(1)DMDD对MIN6细胞胰岛素水平的影响:采用CCK-8法检测细胞活性;酶联免疫吸附测定法（ELISA法）检测细胞胰岛素水平。(2) DMDD对MIN6细胞炎症因子表达的影响:ELISA法检测白细胞介素-6（IL-6），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)含量水平;实时荧光定量PCR法检测IL-6、TNF-α、MCP-1 mRNA的表达;(3) DMDD对MIN6细胞凋亡的影响:Annexin-Ⅴ-FITC/Pl凋亡试剂盒、Hoechst33342/PI荧光双染试剂盒检测细胞凋亡水平;透射电子显微镜观察细胞凋亡形态;实时荧光定量PCR法检测Caspase-3、Bax、Bcl-2 nRNA的表达;western blot法检测Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达。
　　2、DMDD对MIN6细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响:实时荧光定量PCR法检测TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的表达;western blot法检测TLR4、MyD88、细胞核磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、细胞浆磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白的表达。
　　结果:
　　1、DMDD对MIN6细胞胰岛素水平、炎症因子水平、凋亡的影响:(1)DMDD对MIN6细胞胰岛素水平的影响:与PA组相比，DMDDM组、DMDDH组、TAK-242组中分泌至细胞外的胰岛素含量、细胞内的胰岛素含量及细胞内外总胰岛素含量水平均升高，差异均具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)，且呈剂量依赖关系。(2) DMDD对MIN6细胞炎症因子表达的影响:与PA组相比，DMDDL组、DMDDM组、DMDDH组、TAK-242组中IL-6、TNF-α、MCP-1 mRNA和含量水平降低，差异均具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01或p＜0.001)，且呈剂量依赖关系。(3) DMDD对MIN6细胞凋亡的影响:Annexin-V-FITC/P1凋亡试剂盒、Hoechst33342/PI荧光双染试剂盒检测结果均表明，与PA组相比，DMDDL组、DMDDM组、DMDDH组、TAK-242组中MIN6细胞总凋亡率均降低，差异均具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01或p＜0.001)，且呈剂量依赖关系。透射电子显微镜观察MIN6细胞凋亡形态结果表明，与PA组相比，DMDDL组、DMDDM组、DMDDH组、TAK-242组可以改善PA所致的MIN6细胞凋亡形态，且呈剂量依赖关系。实时荧光定量PCR和western blot结果表明，与PA组相比，DMDDM组、DMDDH组、TAK-242组Caspase-3、Bax mRNA水平均降低，Bcl-2 mRNA和蛋白水平均升高，Bcl-2/Bax升高，差异均具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01或p＜0.001)，且呈剂量依赖关系。与PA组相比，DMDDH组、TAK-242组Caspase-3、Bax蛋白水平均降低，差异均具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)，且呈剂量依赖关系。
　　2、DMDD对MIN6细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响:与PA组相比，LPS+PA组中TLR4 mRNA和蛋白、MyD88 mRNA和蛋白、NF-κBp65 mRNA和细胞核p-NF-κB p65蛋白、细胞浆p-IκBα蛋白水平均上调，DMDDH+PA组、TAK-242+PA组中TILR4 mRNA和蛋白、MyD88 mRNA和蛋白、NF-κB p65 mRNA和细胞核p-NF-κB p65蛋白、细胞浆p-IκBα蛋白水平均下调，差异均具有统计学意义(p＜0.05)。与LPS+PA组相比，LPS+DMDDH+PA组中TLR4 mRNA和蛋白、MyD88 mRNA和蛋白、NF-κBp65 mRNA和细胞核p-NF-κB p65蛋白、细胞浆p-IκBα蛋白水平均下调，差异均具有统计学意义(p＜0.05)。与TAK-242+PA组相比，TAK-242+DMDDH+PA组中TLR4 mRNA和蛋白、MyD88 mRNA和蛋白、NF-κB p65 mRNA和细胞核p-NF-κB p65蛋白、细胞浆p-IκBα蛋白水平均下调，差异均具有统计学意义(p＜0.05)。
　　结论:杨桃根中DMDD可升高PA诱导的MIN6细胞胰岛素水平降低，可减轻PA诱导的MIN6细胞炎症反应，可减轻PA诱导的MIN6细胞凋亡。DMDD保护MIN6细胞抗PA诱导功能障碍的作用可能部分机制是通过下调TLR4/MyD88/NF-κB信号通路来实现的。

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中英文缩略词表

摘要

前言

第一章 DMDD对MIN6细胞胰岛素水平、炎症因子水平、凋亡的影响

第一节 DMDD对MIN6细胞胰岛素水平的影响

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二节 DMDD对MIN6细胞炎症因子水平的影响

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三节 DMDD对MIN6细胞凋亡的影响

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二章 DMDD对MIN6细胞TLR4／MyD88／NF-κB信号通路的影响

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

全文总结

参考文献

综述 TLR4／MyD88／NF-κB信号通路与胰岛p细胞功能障碍关系

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文