自噬逃脱线粒体DNA在呼吸机相关性肺损伤中的作用

摘要

目的:探讨机械通气引起线粒体自噬并逃逸的mtDNA介导呼吸机相关性肺损伤的炎症反应。
　　方法:1.将80只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为五组(n=16),依次给予10、20、30和40mL/kg潮气量行机械通气和自主通气;组间按照通气时间,再随机分为四个亚组(n=4),通气时间依次为1.0、2.0、3.0和4.0h。行WB检测自噬蛋白的表达;透射电镜观察自噬小体的数量;并检测ATP、ROS和△Ψm的变化。
　　2.将36只SD大鼠随机分为自主呼吸组(CON)、正常VT组(NTV,VT=10mL/kg)、大VT组(HTV,VT=40mL/kg)三组(n=12)。所有大鼠均气管切开后行气管插管,CON组保持自主呼吸,NTV和HTV组按分组的VT机械通气;通气4h后收集血清、BALF和肺组织标本。测定肺组织湿/干比值(W/D),观察肺组织病理学和超微结构改变;用ELISA测定血清和BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α浓度;BCA法测定BALF中总蛋白水平和细胞计数;用RT-qPCR和WB分别检测肺组织中LC3B、COXⅣ和NF-κB的mRNA及蛋白表达。
　　3.将48只SD大鼠随机分为自主呼吸组(CON)、大VT组(HTV)、自噬增强组(AmA)和自噬抑制组(CsA)4组。除CON组外均予40mL/kg的VT通气4.0h。计算各组肺组织W/D;观察肺组织形态学变化;测量BALF中渗出总蛋白和细胞计数;检测血清和BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α、MPO和MIP-2浓度;检测血清中DNase-Ⅱ的含量;提取mtDNA并行RT-qPCR检测COXⅣ表达;RT-qPCR和WB检测各组LC3B的表达并用IF追踪分析mtDNA的来源。
　　结果:VT超过30mL/kg、通气大于2.0h即可引起线粒体自噬，并伴ATP合成障碍、ROS积累和△Ψm下降。大VT机械通气可明显引起肺组织发生急性炎症性损伤，且肺组织其水肿、形态学损伤和炎症反应程度与自噬程度与呈正相关（均P＜0.05）。增强自噬时，血清中DNase-Ⅱ的表达下调（P＜0.05），胞内mtDNA增加(P＜0.05)，肺组织炎症反应加重(P＜0.05)。
　　结论:呼吸机相关性肺损伤可能与机械通气引起线粒体自噬导致mtDNA逃逸至胞浆介导炎症反应有关。

目录

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个人简历

主要英文及缩略词

摘要

第一章 前言

1．1．1 自噬的概念及作用

1．1．2 自噬的分类

1．1．3 自噬的分子机制

1．2 线粒体自噬与mtDNA

1．2．1 线粒体自噬的概述

1．2．2 线粒体自噬相关指标

1．2．3 mtDNA特点

1．2．4 mtDNA与自噬

1．3 研究目的及意义

参考文献

第二章 机械通气诱导自噬的形成

2．1 实验动物

2．2 主要试剂及设备

2．3 实验技术路线

2．4 实验步骤与方法

2．4．1 机械通气动物模型建立及标本收集

2．4．2 肺组织LC3B、SQSTM／p62和Beclin-1蛋白表达检测

2．4．3 透射电镜寻找自噬小体

2．5 数据处理与分析

2．6 结果

2．7 讨论

2．8 结论

参考文献

第三章 机械通气诱导线粒体损伤而发生自噬

3．1 实验动物

3．2 主要试剂与仪器

3．3 实验技术路线

3．4 实验步骤与方法

3．4．1 机械通气动物模型建立及标本收集

3．4．3 线粒体损伤检测：ATP、ROS和ΔΨm

3．4．4 线粒体自噬LC3B、PINK1／Parkin和Mfn1蛋白质表达

3．5 数据分析与处理

3．6 结果

3．7 讨论

3．8 结论

参考文献

第四章 自噬及mtDNA参与呼吸机相关性肺损伤的发生

4．1 实验动物

4．2 主要试剂与仪器

4．3 实验技术路线

4．4 实验步骤与方法

4．4．1 机械通气动物模型建立及标本收集

4．4．2 呼吸机相关性肺损伤模型的验证

4．4．3 肺组织LC3B、COXIV和NF-κB mRNA和蛋白表达

4．5 数据分析与处理

4．6 结果

4．7 讨论

4．8 结论

参考文献

第五章 自噬增强或抑制对呼吸机相关性肺损伤的影响

5．1 实验动物

5．2 主要试剂与仪器

5．3 实验技术路线

5．4 实验步骤与方法

5．4．1 机械通气动物模型建立及标本收集

5．4．2 呼吸机相关性肺损伤模型的验证

5．4．3 检测mtDNA和DNase-II表达

5．4．4 分析mtDNA来源：是否来源于自噬溶酶体

5．5 数据分析与处理

5．6 结果

5．7 讨论

5．8 结论

参考文献

综述 mtDNA与呼吸机相关性肺损伤的炎症反应

致谢

攻读硕士期间发表的论文