鼻咽癌细胞CNE2及其放射抗拒细胞株CNE2/70R EGFR信号通路改变与放射抗拒相关性研究

摘要

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）一类发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤，中国的广东、广西、福建，湖南等地为多发区。临床上鼻咽癌以鳞状细胞癌最多，其中又以低分化鳞癌最多，其具有对射线较敏感的特点。目前鼻咽癌的主要治疗手段是放射治疗，出现放射抗拒或远端转移是治疗失败的主要原因。因此研究和探讨预测个体肿瘤放射敏感性的方法和指标，寻找放射增敏途径成为亟待解决的问题。由于肿瘤细胞存在异质性，即使组织学上分化程度相同的鳞状细胞癌也会表现出不同的放射敏感性。因此，如果用同一来源但放射敏感性不同的一对细胞做为对象进行放射敏感性相关因素对照研究，将有更多的优势。
　　目的：以鼻咽癌细胞CNE2及其放射抗拒细胞株CNE2/70R为对象，研究两株细胞放射敏感性，药物敏感性，生长速度，及经射线照射后凋亡，细胞周期变化的差异。检测两株细胞周期相关蛋白CUEDC2的表达量，初步探讨两株细胞CUEDC2的表达与放化疗敏感性之间的关系。检测两株细胞EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白的表达情况，初步探讨EGFR信号通路与放射敏感性之间的关系。
　　方法：生长曲线法、裸鼠成瘤法验证两株细胞体内体外生长速度。克隆形成法、裸鼠成瘤法研究两株细胞体内体外放射敏感性。MTT法检测不同浓度多西紫杉醇(100μmol/L、1μmol/L、0.01μmol/L、0.0001μmol/L)、顺铂(100ug/mL、10ug/mL、1ug/mL、0.1ug/mL、0.01ug/mL)对两株细胞的生长抑制作用。流式细胞术AnnexinⅤ/PI染色法检测细胞经0GY、4GY、8GY、12GYX射线照射后细胞凋亡的发生率，流式细胞PI染色检测两株细胞经0GY、4GY、8GY、12GYX射线照射后细胞周期的改变。RT-PCR检测两株细胞CUEDC2、EGFR、AKT、ERK的相对mRNA扩增水平。Western Blot检测两株细胞CUEDC2、EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白的表达。
　　结果：(1)生长速度：细胞生长曲线、裸鼠成瘤体内外验证了鼻咽癌放射抗拒株细胞CNE2/70R生长速度较鼻咽癌放射敏感株细胞CNE2慢;裸鼠成瘤实验、克隆形成实验体内外验证了CNE2细胞相较CNE2/70R对X射线敏感。(2)MTT结果显示顺铂对CNE2的IC50为1.184ug/mL，对CNE2/70R的IC50为2.637ug/mL，CNE2与CNE2/70R对顺铂的敏感性无明显差别（p＞0.05）;多西紫杉醇对CNE2的IC50为0.007μmol/L，对CNE2/70R的IC50为0.054μmol/L，CNE2对多西紫杉醇的敏感性更高(p＜0.05)。(3)细胞细胞周期结果显示，细胞照射0GY，4GY，8GY，12GY后，G0/G1期，S期细胞数减少，G2/M期细胞数增多，CNE2、CNE2/70R均出现G2/M期阻滞，CNE2/70R细胞G2/M期阻滞更明显(p＜0.05）。(4)细胞照射0Gy，4Gy，8Gy，12Gy后，两细胞凋亡率均随照射剂量增加而增加，同一组CNE2细胞凋亡率高于CNE2/70R细胞，两细胞凋亡率比较差异具有统计学意义(p＜0.05)。(5)qRT-PCR结果显示放射抗拒株细胞CNE2/70R的CUEDC2基因、EGFR基因表达较CNE2细胞高(p＜0.05)，AKT基因、ERK基因表达较CNE2低(p＜0.05)。(6)Western Blot结果显示CNE2/70R的CUEDC2蛋白表达量较CNE2表达升高(p＜0.05)，CNE2/70R的EGFR、AKT蛋白活化程度较CNE2高(p＜0.05)，ERK蛋白活化程度与CNE2相当。
　　结论：(1)CNE2瘤体生长速度明显比CNE2/70R的快，CNE2细胞对X射线更加敏感。(2)药物敏感性：鼻咽癌细胞CNE2对化疗药物多西紫杉醇更加敏感。(3)CNE2/70R细胞株较亲本细胞CNE2具有更明显的G2/M期阻滞，相同X射线照射下CNE2/70R凋亡率更少。(4)CNE2/70R中CUEDC2蛋白的表达量和基因扩增量较CNE2的多，CUEDC2的上调表达可能跟细胞的放疗抗拒性有关;CNE2/70R中EGFR蛋白、AKT蛋白活化程度较CNE2的高，CNE2/70R中ERK活化程度与CNE2的相当，EGFR信号通路活化可能与细胞放疗抗拒有关。

目录

声明

个人简历

中英文缩略词表

摘要

前言

第一章 鼻咽癌细胞株CNE2及其放疗抗拒细胞株CNE2／70R的差异分析

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二章 CUEDC2与放射抗拒性

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第三章 EGFR信号通路与放射敏感性

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

全文结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间取得的成果和发表的学术论文