鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE1/70R的建立及放射抗拒机制的初步探讨

摘要

背景:
　　鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方地区常见的一种头颈部恶性肿瘤，发病率占世界80％左右。鼻咽癌在临床上的病理分型主要为低分化鳞癌，对射线敏感，手术治疗难以根治。放疗是目前鼻咽癌的首要治疗手段，但是容易发生复发和转移，治疗失败的主要原因是鼻咽癌组织中存在一定比例的放射抗拒细胞细胞。因此研究放射抗拒机制，寻找放射增敏途径成为亟待解决的问题。由于肿瘤细胞存在异质性，即使组织学上分化相同的鳞状细胞癌也会表现出不同的放射敏感性。显然，如果以同一来源但具有不同放射敏感性的一对细胞为对象进行放射敏感性相关因素对照研究，将有更多的优势。
　　目的:
　　体外实验模拟鼻咽癌临床常规分割放疗，建立经大剂量射线照射后放射抗拒细胞模型CNE1/70R。研究两株细胞放射敏感性，药物敏感性，及经射线照射后凋亡，细胞周期变化的差异。用裸鼠成瘤实验体内验证放射抗拒株细胞CNE1/70R与放射敏感株细胞CNE1在生长速度方面差异。初步探讨两株细胞周期相关蛋白CUEDC2的表达与放射抗拒之间的关系。通过应用含人类全基因组序列芯片对两个放射敏感性不同的鼻咽癌细胞株进行检测，比较其基因表达谱的变化，寻找与鼻咽癌放射敏感性密切相关的基因。
　　方法:
　　将复苏的人鼻咽癌细胞系CNE1进行培养、传代，取对数生长期的细胞进行实验。用临床常规分割根治剂量70Gy（6Mv X线，70Gy/35天，2Gy/天，1次/日，5次/周）体外照射，建立鼻咽癌细胞模型CNE1/70R。生长曲线检测细胞倍增时间。MTT法检测不同浓度多西紫杉醇(100、10、1、0.1、0.01μmol/L)、顺铂（1、0.1、0.01、0.001、0.0001μg/ml）对两株细胞的生长抑制作用。细胞照射0，1，2，3，4，6，8Gy后，利用克隆形成实验，拟合细胞存活曲线，比较放射敏感性。流式细胞术AnnexinⅤ/PI染色法检测细胞经0、4、8、12Gy照射后细胞凋亡发生率的变化，流式细胞PI染色检测两株细胞经8Gy照射周期的改变。基因芯片技术检测两株细胞的差异表达的基因。裸鼠实验体内验证两株细胞生长速度。Western Blot检测两株细胞CUEDC2蛋白的表达，qRT-PCR检测两株细胞CUEDC2基因的表达。
　　结果:
　　(1) CNE1/70R细胞群体倍增时间长于亲代细胞。CNE1、CNE1/70R倍增时间分别为（1.483±0.046）d，(1.586±0.069)d。(2)细胞株CNE1/70R形成集落能力强于CNE1细胞，放射生物学相关指标均提示CNE1/70R较CNE1具有放疗抵抗，并且具有统计学差异p＜0.05。(3)放射抗拒细胞CNE1/70R与敏感株相比对药物敏感性升高，多西紫杉醇和顺铂对CNE1和CNE1/70R细胞有明显的抑制作用，IC50分别为0.049μmol/L vs0.001μmol/L。1.008μg/mL vs0.337μg/mL，CNE1/70R对多西紫杉醇利顺铂的敏感性增加。(4)细胞周期的结果显示，细胞经8Gy射线照射24小时后，G0/G1期，S期细胞数减少，G2/M期细胞数增多，CNE1、CNE1/70R均出现G2/M期阻滞，CNE1细胞G2/M期阻滞更明显。CNE1与CNE1/70R周期改变差异(p＜0.05)具有统计学意义。(5)细胞照射0Gy，4Gy，8Gy，12Gy后，两细胞凋亡率均随剂量增加而增加，CNE1细胞早期、晚期凋亡率均高于CNE1/70R细胞，两细胞凋亡率比较差异具有统计学意义(p＜0.05)。(6)人鼻咽癌放射抗拒株细胞移植瘤生长速度较人鼻咽癌放射敏感细胞移植瘤慢。(7)两组鼻咽癌细胞株基因都有差异的共有1191条，1172条表达上调，19条表达下调。功能涉及不同的分子功能分类，参与多个生物学过程。(8) qRT-PCR结果显示放射抗拒株细胞CNE1/70R的CUEDC2基因相对表达较CNE1细胞有所上调。Western Blot结果显示CNE1/70R的CUEDC2蛋白表达量较CNE1表达升高。
　　结论:
　　(1)采用临床常规分割放疗方法单次2Gy照射35次模式可建立稳定的人鼻咽癌放射抗拒株CNE1/70R。
　　(2)生长速度:细胞生长曲线实验、裸鼠成瘤实验均显示鼻咽癌放射抗拒株细胞CNE1/70R生长速度较鼻咽癌放射敏感株细胞CNE1慢。
　　(3)药物敏感性:鼻咽癌抗拒株细胞CNE1/70R细胞对化疗药物多西紫杉醇、顺铂更加敏感。临床上为复发鼻咽癌患者治疗提供新的理论基础。
　　(4) CNE1/70R细胞株较亲本细胞具有更突出的放射抗拒性，周期改变减小及抗凋亡能力增加。
　　(5) CUEDC2表达上调可能CNE1/70R放射抗拒性增加主要原因之一。
　　(6)基因芯片结果显示放射敏感性的分子机制极为复杂，是多基因协同作用的结果。涉及到DNA损伤修复、细胞周期调控、肿瘤细胞凋亡、信号转导，应激反应等多种遗传学改变。

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主要缩略语

摘要

前言

第一部分 鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE1／70R的建立及其与亲代细胞差异的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分 CUEDC2与放射抗拒性

前言

1 材料

2．方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 脑部肿瘤放射抗拒性研究

致谢

攻读学位期间取得的成果和发表的学术论文