核糖体蛋白L34在骨肉瘤中的表达及对人骨肉瘤细胞增殖的影响

摘要

背景:
　　骨肉瘤是对儿童和青少年的健康危害极大的恶性骨肿瘤。但是，骨肉瘤的发病率低，肿瘤异质性较高，因此，近二十年来，研究者在提高骨肉瘤治疗的效果和改善骨肉瘤患者的预后上取得的进展甚微。核糖体蛋白L34(ribosomal protein L34，RPL34)被认为除了参与核糖体生物合成外，还具有多种核糖体外功能。早期研究发现RPL34参与了原核生物的细胞增殖调控，近年来研究发现RPL34在部分恶性肿瘤的增殖中扮演了重要角色，但在人骨肉瘤中的功能尚未明确，并且RPL34介导恶性肿瘤细胞增殖调控的分子机制仍不清楚。
　　目的:
　　明确RPL34在人骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞株中的表达情况，以及对人骨肉瘤细胞增殖和骨肉瘤患者预后的影响;初步探讨RPL34介导人骨肉瘤细胞增殖调控的分子机制;通过本研究为骨肉瘤的靶向治疗提供新的思路。
　　方法:
　　1、采用Real time-PCR检测11例骨肉瘤患者的癌和癌旁组织样本中RPL34 mRNA的表达水平。
　　2、采用免疫组织化学方法检测95例骨肉瘤患者的癌组织和60例正常骨组织中RPL34蛋白的表达水平。
　　3、计算上述95例骨肉瘤组织样本免疫组织化学染色得分的均值，并把95例样本划分为RPL34高表达组和低表达组;采用Kaplan-Meier法估计RPL34高表达组和低表达组患者的生存率，采用log-rank检验比较两组患者的生存曲线是否有差别。
　　4、采用Real time-PCR检测人成骨细胞hFOB1.19及骨肉瘤细胞株(U2OS、MG-63、HOS和Saos-2)中RPL34 mRNA的表达水平。
　　5、设计和筛选针对RPL34基因的RNA干扰靶点，构建RNA干扰慢病毒并转染人骨肉瘤细胞Saos-2，采用Real time-PCR和Western blot验证RPL34 RNA干扰靶点的敲减效率。
　　6、采用Cellomics细胞计数检测、MTT检测、细胞周期检测、AnnexinV-APC凋亡检测及克隆形成实验等来评估RPL34敲减对Saos-2细胞生物学行为的影响。
　　7、分别基于UCSC数据库和STING数据库进行RPL34基因的转录调控因子筛查和蛋白-蛋白互作网络构建，然后对整合关系网络中的基因进行GO和KEGG通路富集分析，获得调控RPL34基因表达的转录因子和介导RPL34调控人骨肉瘤细胞增殖的下游相互作用蛋白。
　　结果:
　　1、11例骨肉瘤患者的癌和癌旁组织样本中:7例(7/11，63.64％)患者的骨肉瘤组织中RPL34的表达显著高于癌旁组织;3例(3/11，27.27％)患者的骨肉瘤组织和癌旁组织中RPL34的表达无差异;1例(1/11，9.09％)患者的骨肉瘤组织中RPL34表达低于癌旁组织。
　　2、免疫组织化学检测表明:75例(78.95％，75/95)骨肉瘤患者的癌组织染色为强阳性，20例(21.05％，20/95)患者的癌组织染色为弱阳性，而60例正常骨组织染色均为弱阳性;骨肉瘤组织中RPL34蛋白的表达水平明显高于正常骨组织。
　　3、对上述95例骨肉瘤患者的生存分析显示:RPL34蛋白高表达患者的3年生存率为35.42％(17/48)，RPL34蛋白低表达患者的3年生存率为61.70％(29/47)，RPL34蛋白高表达患者的预后明显较差。
　　4、RPL34 mRNA在4株骨肉瘤细胞(U2OS、MG-63、HOS和Saos-2)中的表达均高于人成骨细胞hFOB1.19。
　　5、RPL34表达敲减使Saos-2细胞的增殖速率受到显著抑制，细胞的集落形成数目减少，并且诱导了Saos-2细胞凋亡和G2/M期阻滞。
　　6、生物信息学分析获得了参与RPL34基因转录调控的11个因子，即MYC及MYC相关因子X(MYC associated factor X，MAX)、CEBPB、E2F6、GABP、NFKB、NRSF、SPI1、TAF1、TBP、YY1，以及RPL34下游与其相互作用的100个蛋白;进一步的GO和KEGG通路富集分析提示:RPL34基因的转录表达受原癌基因蛋白MYC调控，并且真核翻译起始因子3的亚基(EIF3A、EIF3F或EIF3G)可能介导了RPL34对人骨肉瘤细胞的增殖调控。
　　结论:
　　1、RPL34在骨肉瘤中高表达，并促进人骨肉瘤细胞的增殖。
　　2、RPL34高表达的骨肉瘤患者临床预后较差。
　　3、RPL34可能通过“MYC/RPL34/EIF3(EIF3A、EIF3F或EIF3G)”信号轴而参与了人骨肉瘤细胞的增殖调控。

目录

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缩略词表

摘要

前言

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

五、结语

参考文献

综述 核糖体生物合成、翻译起始与肿瘤

致谢

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