以脂肪细胞分泌因子PAI-1为靶点的减肥中药复方制剂的初步筛选

摘要

目的：随着社会的发展，肥胖是威胁人类健康的因素，我国的肥胖问题形势十分严峻。但是目前对肥胖病因学的研究机制尚不明确，主要认为可能是饮食搭配不恰当、遗传变异、缺乏活动和社会大环境等原因使人体内能量代谢的失调。大量研究显示人体内纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的过分表达是影响肥胖的关键因素，在人体内起重要的调节作用。本实验将前体脂肪细胞培养成为成熟的脂肪细胞，在此基础上通过PCR与质粒转染的技术，研究六种中药复方制剂对人PAI-1基因表达的影响，试图从分子生物学水平探讨中药制剂对肥胖的作用机理，为临床肥胖的治疗提供药理学基础。
　　方法：
　　1.中药制剂药液的制备及成熟脂肪细胞的培养：通过文献检索，将六剂中药分别以八倍水回流2次，弃药渣、过滤、离心，再将两次初步提取的药液混合后浓缩至1g/ml，灌装灭菌，分装备用，4度保存。常规体外培养前体脂肪细胞3T3-L1，待细胞生长至完全融合后通过经典的鸡尾酒法将前体脂肪细胞3T3-L1诱导分化成为成熟的脂肪细胞，准备后续试验。
　　2.用1mg/ml的中药制剂刺激成熟的脂肪细胞24h后提取RNA，采用实时荧光定量PCR技术分别检测6种中药制剂对成熟脂肪细胞分泌因子PAI-1 mRNA水平的影响。
　　3.克隆人PAI-1基因启动子片段，构建含有人PAI-1启动子片段的荧光素酶报告基因载体并进行测序鉴定。将成功构建的重组质粒瞬时转染到成熟脂肪细胞中，转染24h后加入1mg/ml的中药制剂刺激转染成功的成熟脂肪细胞并继续培养24h，收集细胞，测其荧光素酶活性，筛选出对人PAI-1启动子表达有影响的制剂。
　　结果：
　　1.通过荧光定量PCR技术，与对照组相比，减肥胶囊药液、防风通圣散和泽泻汤对诱导成熟的脂肪细胞的PAI-1mRNA表达具有统计学意义（P＜0.05），而其余各药成熟脂肪细胞PAI-1mRNA的表达无明显统计学意义（P＞0.05），提示此三剂药物可能具有降低诱导成熟的脂肪细胞PAI-1mRNA表达的作用。
　　2.成功构建了含有人PAI-1启动子片段的基因载体，并且所构建的重组质粒序列与基因库中人PAI-1启动子序列匹配率高达98％，虽然有碱基发生无义突变但是不影响PAI-1启动子表达，提示本实验PAI-1启动子的成功构建。
　　3.在脂质体的介导下，将重组质粒与内参海肾报告基因载体同时瞬时转染进入诱导成熟的脂肪细胞中，以pcDNA为对照载体，在转染48小时后，与pGL3-Basic相比pGL3-Basic-1.1的荧光素酶活性具有统计学意义（P＜0.05），pGL3-Basic-2.1的荧光素酶活性不具有统计学意义（P＞0.05），故将pGL3-Basic-1.1用于后续试验。
　　4.与对照组相比，减肥胶囊药液和防风通圣散对人PAI-1启动子（1.1kb）荧光素酶活性的影响具有统计学意义（P＜0.05），防己黄芪汤、泽泻汤、参苓白术散和小承气汤对人PAI-1启动子（1.1kb)荧光素酶活性的影响无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.减肥胶囊药液、防风通圣散和泽泻汤具有降低诱导成熟的脂肪细胞PAI-1mRNA表达的作用。
　　2.成功构建的含有PAI-1启动子的瞬时转染的诱导分化成熟的脂肪细胞模型，可以简单方便的从六种前期研究有效的减肥中药中筛选出对人PAI-1启动子荧光素酶活性表达有影响的药物。
　　3．减肥胶囊药液、防风通圣散能够抑制人PAI-1启动子的荧光素酶活性，提示减肥胶囊和防风通圣散可能是通过抑制PAI-1启动子的活性来起到减肥的作用。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

致谢

参考文献

附录

附录1

附录2 综述: 浅谈纤溶酶原激活物抑制剂-1与肥胖的关系

附录3 在读期间论文论著、科研情况及奖励情况