苦参碱对脂多糖诱导人腹膜间皮细胞发生上皮细胞间充质转化的作用研究

摘要

腹膜透析是终末期肾脏病(End-stage renal disease，ESRD)患者进行肾脏替代治疗(renal replacement therapy，RRT)的主要方式之一。研究发现腹透患者体内的慢性炎症诱导的腹膜间皮细胞发生上皮细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是引起腹膜纤维化、腹膜结构和功能改变的重要原因，最终将导致腹膜透析技术失败、患者退出治疗。大肠杆菌等革兰阴性菌感染引起的腹透相关性腹膜炎在我国南方地区十分常见。苦参碱具有抑菌、抗炎和抗纤维化等多种药理作用，本课题组前期实验研究发现苦参碱还可以抑制大肠杆菌生物膜形成。然而，苦参碱对炎症状态下的腹膜间皮细胞发生EMT的作用研究尚不清楚，因此本实验用大肠杆菌细胞壁主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的腹膜间皮细胞EMT模型，结合相关EMT标志物、miRNAs，探讨苦参碱对HPMC发生EMT的作用。
　　目的:采用LPS诱导人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelium cell，HPMC)发生EMT的体外模型，通过细胞水平的研究探讨苦参碱对HPMCs发生EMT的作用，同时研究miR-29b、miR-129-5p表达水平的变化。
　　方法:MTT法及细胞形态学观察测定LPS、苦参碱对HPMCs生长活性影响，探究用LPS诱导HPMCs发生EMT模型的适宜浓度以及苦参碱对LPS诱导HPMCs发生EMT模型作用的有效浓度。划痕实验显微镜下观察空白组、LPS组、LPS+苦参碱中剂量组3组0h、8h、16h、24h HPMCs迁移能力的变化。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)测24h空白组、LPS组、LPS+低剂量苦参碱组、LPS+中剂量苦参碱组、LPS+高剂量苦参碱组5组HPMCs上皮细胞标志物钙粘附蛋白E(E-cadherin)、间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、miR-29b、miR-129-5p的表达水平。蛋白免疫印迹分析(western blot analysis)测72h空白组、LPS组、LPS+低剂量苦参碱组、LPS+中剂量苦参碱组、LPS+高剂量苦参碱组5组HPMCs E-cadherin、α-SMA的蛋白含量的变化。
　　结果:MTT实验发现0.1g/l～2.0g/l苦参碱对HPMCs生长活性不影响。0.5ug/ml～20ug/ml LPS对HPMC生长活性不影响。同时参照文献选择LPS诱导浓度:10ug/ml，苦参碱干预浓度:0.2g/l(低剂量)，0.4g/l(中剂量)，0.6g/l(高剂量)。显微镜下观察LPS、LPS+0.6g/l苦参碱刺激HPMCs72h后细胞生长状态与空白组相比不受影响。划痕实验显示LPS处理增强了HPMCs的迁移能力，苦参碱可抑制LPS诱导的HPMCs迁移能力增强。10ug/ml LPS可诱导HPMCs发生EMT，表现为E-cadherin表达量较空白对照组下降、α-SMA表达量上升。苦参碱可抑制LPS诱导的HPMCs EMT,表现为E-cadherin表达回升，α-SMA表达下降，呈浓度相关性。LPS可诱导HPMCs miR-29b、miR-129-5p表达水平降低，苦参碱干预可提升HPMCs miR-29b、miR-129-5p表达水平，呈浓度相关性。
　　结论:LPS可诱导H-PMCs发生EMT，减少HPMCs miR-29b、miR-129-5p表达。苦参碱可抑制LPS诱导HPMCs发生的EMT，使HPMCs miR-29b、miR-129-5p表达回升。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

1、材料

2、方法

3、实验结果

4、讨论

5、结论

参考文献

附录

综述 腹膜间皮细胞EMT在腹膜纤维化中的研究进展及意义

致谢

攻读学位期间发表的学术论文