靶向HER3适配体--药物偶联物递送系统的构建及抑瘤作用研究

摘要

癌症是人类健康的最大威胁之一，伴随医学的发展，肿瘤治疗策略已经趋于多样化，有联合治疗、免疫疗法，甚至精准医疗，但在部分肿瘤患者中化疗依旧作为一线治疗方案被使用。如何尽量克服、避免化疗药物因非靶向性带来的毒副作用，一直是临床关注的热点之一。构建靶向递送系统，可提高靶组织局部药物浓度，减少全身毒副作用，实现药物的高效、安全递送，是一种很有前景的给药方法。目前已有两种抗体药物偶联物(ADC)经FDA批准上市且获得良好药效。但在抗体-药物制备过程中的DAR（Drug-anbibody ratio）均一性、裸抗体的免疫原性等问题还未得到良好控制。
　　适配体(Apt)是一种独特的单链寡核苷酸，其功能类似抗体，有着靶分子范围广泛、高特异性及亲和性以及免疫原性低等优势。除可作为药物(例如FDA批准上市的Macugen)单独应用外，更多可作为药物递送系统中的靶向载体。本论文关注化疗药物的靶向递送系统的概念性验证研究，构建适配体-药物偶联物递送系统(ApDC)，证明其显著提高药物治疗指数，降低药物毒副作用的应用前景。
　　本文首先应用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)，以人的表皮生长因子受体3（HER3）的胞外结构域(ECD)为靶目标，筛选获得具有高亲和力和高特异性的候选Apt。选择阿霉素(DOX)为递送对象，薄膜分散法制备脂质体阿霉素(Lip-DOX)。通过“后插入法”连接Apt，构建稳定的适配体-脂质体-阿霉素(Apt-Lip-DOX)。通过包封率、粒径大小、zeta电势、释放度等理化性质指标，考察并优化Apt-Lip-DOX制备工艺。体外实验中，在MCF-7 HER3+、BT474 HER3++胞及阴性对照293THER3-+胞中考察该ApDC系统的入胞情况及半数抑制浓度（IC50）并对内吞途径进行初步探索。体内实验中，选择MCF-7HER3+荷瘤小鼠模型，考察ApDC针对其他对照组在靶向性、有效性及安全性方面的优势。
　　第一部分 HER3ECD Apt的筛选和鉴定。选择HER3ECD质粒瞬时转染293E细胞，表达回收HER3ECD蛋白，作为筛选的靶蛋白。采用经优化的“QPCR-磁珠分选”SELEX方法，经四轮十次筛选，获得靶向HER3ECD的候选Apt。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)并拟合亲和力曲线，得出Apt＃7及＃13亲和力常数较佳，Kd值分别为116±23 nM、98±9.7nM。通过细胞流式实验及激光共聚焦结果显示，该适配体针对高表达HER3的乳腺癌细胞系具有较高的亲和力及特异性。
　　第二部分 ApDC递送系统的构建及优化。优化脂质体阿霉素的制备工艺，通过DSPE-PEG2000连接Apt，采用“后插入法”制备稳定的ApDC，即Apt-Lip-DOX。考察Apt-Lip-DOX的理化性质，粒径为170±25 nm，zeta电势为-45.9±6.31 mV，结构稳定。超滤法结合高效液相色谱(HPLC)测定DOX药物包封率为55±5％。模拟体内环境药物释放度结果显示:同等条件下，游离的DOX在1h释放度接近100％，而Apt-Lip-DOX24h释放度仅为20％，充分证明了该递送系统缓释递送的优势。
　　第三部分 ApDC系统体外胞吞机制和药效实验。细胞水平上，选择MCF-7 HER3+细胞及阴性对照293THER3-，比较Apt的介导是否增加递送系统的入胞量。并通过不同内吞途径抑制剂结合活细胞观测站，初步探讨该ApDC入胞途径机制。结果表明ApDC的入胞依赖于HER3的表达及Apt的存在，突出HER3 Apt的优势，同时该ApDC主要通过网格蛋白介导的内吞作用完成内吞。进一步选择MCF-7 HER3+、BT474HER3+两株细胞系经实时细胞检测(RTCA)考察DOX不同递送形式的IC50值，同时加入293THER3-细胞作为对照。结果显示，在三株细胞系中，Lip-DOX针对游离DOX的IC50值降低，且均具有统计学差异，体现脂质体递送系统的优势。Apt-Lip-DOX在HER3高表达的MCF-7、BT474中较游离DOX组出现显著性统计学差异，在293T细胞中未表现出该优势。证明所筛选适配体在递送系统中发挥一定的靶向优势，增加体外靶向肿瘤细胞的杀伤力，为后续体内实验奠定基础。
　　第四部分 ApDC系统荷瘤小鼠体内肿瘤靶向性和药效、毒性实验。动物水平上，选择MCF-7荷瘤小鼠，考察体内ApDC的肿瘤靶向性、有效性及安全性。1）肿瘤靶向性:按照ApDC制备工艺，选择包裹量子点(QD)，制备Apt-Lip-QD，同时Lip-QD为对照组，尾静脉注射MCF-7荷瘤小鼠1h后进行活体成像，观察荧光分布判断药物的体内分布。结果显示ApDC表现出良好的靶向性，解剖瘤体与Lip-QD相比，具有明显的统计学差异。2）体内抑制肿瘤药效实验:设置空白对照组(Blank，等体积生理盐水)以及实验组DOX、Lip-DOX、Apt-Lip-DOX共四个组别，实验组的DOX给药量为5mg/kg，每三天尾静脉注射给药。结果显示:给药18天后，Apt-Lip-DOX抑瘤效果针对Blank组具有非常显著的统计学差异，同时较DOX组也表现出较大的优势。3)体内毒性考察:分别考察小鼠给药期间体重状态，60天存活率，组织病理切片。结果显示:给药期间Apt-Lip-DOX组小鼠状态、体重维持在正常水平，DOX组则在20天出现体重急剧下降的现象。不同组别(DOX、Lip-DOX、Apt-Lip-DOX)小鼠60天以内的存活率分别为O、40％、100％。小鼠死亡后对各脏器做H&E病理切片观察病变损伤情况，在DOX组中，心脏切片显示出现脂肪变性，散在出血点，血管扩张出血等病变;肝脏切片出现局灶肝细胞坏死。在Lip-DOX组中也出现轻微病变，Apt-Lip-DOX组所有组织均正常。综上体内实验结果，充分证明了该ApDC的靶向性、高效性及安全性。
　　综上，本研究建立并完善SELEX技术路线，为其他靶点筛选提供参考;靶向HER3的治疗策略将会为肿瘤靶向治疗或逆转EGFR抑制剂耐药带来新的思路;以化疗药(DOX)为例，通过构建ApDC递送系统，对其靶向性、抑瘤作用等进行研究，为实现化疗药的高效低毒递送提供参考。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

第一部分 HER3ECD蛋白表达纯化及SELEX条件下适配体的筛选、验证

1．1 实验材料

1．1．1 实验仪器

1．1．2 实验细胞、试剂及引物

1．1．3 实验溶液及配置

1．2 实验方法

1．2．1 HER3ECD蛋白的表达及纯化

1．2．2 SELEX筛选过程

1．2．3 ELISA亲和力验证

1．2．4 细胞流式验证适配体的功能性

1．3．1 靶蛋白HER3ECD的纯化与鉴定

1．3．2 SELEX筛选所得序列

1．3．3 HER3ECD Apt亲和力鉴定和结合特异性分析

1．3．4 激光共聚焦适配体与HER3抗体共定位

1．4 讨论与分析

1．5 小结

第二部分 ApDC递送系统构建及条件优化

2．1 实验材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验试剂及序列合成

2．1．3 实验溶液及配置

2．2 实验方法

2．2．1 HPLC对阿霉素定量方法学

2．2．2 脂质体制备工艺优化及包封率测定

2．2．3 ApDC递送系统构建

2．2．4 制剂理化性质考察

2．3 实验结果

2．3．1 HPLC对阿霉素定量方法学的建立

2．3．2 脂质体制备工艺优化

2．3．3 ApDC理化性质考察

2．4 讨论与分析

2．5 小结

第三部分 细胞水平上ApDC药效及内吞机制研究

3．1 实验材料

3．1．1 实验仪器

3．1．2 实验试剂

3．2 实验方法

3．2．1 Apt介导ApDC入胞研究

3．2．2 细胞水平药物毒性分析

3．2．3 ApDC递送系统的内吞机制研究

3．3 实验结果

3．3．1 Apt介导ApDC入胞研究

3．3．2 体外对肿瘤细胞活力影响

3．3．3 ApDC递送系统的内吞机制研究

3．4 讨论与分析

3．5 小结

第四部分 动物水平考察ApDC靶向性、有效性及安全性

4．1 实验材料

4．1．1 实验仪器

4．1．2 实验动物、试剂

4．1．3 实验溶液及配置

4．2 实验方法

4．2．3 ApDC的有效性研究

4．2．4 ApDC的安全性研究

4．3 实验结果

4．3．1 ApDC的靶向性研究

4．3．2 ApDC的有效性研究

4．3．3 ApDC的安全性研究

4．4 讨论与分析

4．5 小结

全文总结

参考文献

附录

综述 基于适配子的靶向治疗药物研究进展

致谢

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