微囊藻毒素-LR诱导肝细胞恶性转化中氧化损伤与GCLC蛋白磷酸化水平研究

摘要

目的：本课题采用已建立的MC-LR诱导人肝细胞株WRL68恶性转化模型，研究肝细胞恶性转化过程中PP2A活性、GCLC磷酸化、蛋白表达与氧化应激水平的变化情况及其相互关系，为进一步揭示GCLC蛋白磷酸化和氧化损伤在MC-LR致癌过程中的作用提供科学依据。
　　方法：采用10nmol/L MC-LR连续染毒人肝细胞株WRL68，同时设立对照组(含0.01％DMSO浓度的PBS)。每3天传代一次，使细胞始终暴露于10nmol/L的MC-LR，连续培养至第25代，将不同转化时期的细胞按照传代次数标记为P10、P15和P25。本研究采用酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2'-deoxyguano-sine，8-OHdG）的含量、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的含量、GSH合成限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthethase，γ-GCS）活性;用实时荧光定量PCR法检测γ-GCS的催化亚基（Glutamate cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）的mRNA表达水平;用免疫印迹法(Western blot，WB)检测GCLC的总蛋白和磷酸化蛋白(p-GCLC)的表达水平;采用以磷肽为底物的染色法检测蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase2A，PP2A)酶活性。
　　结果：1.培养至第15代时，与同代对照组相比，P15染毒组氧化损伤产物8-OHdG及MDA含量升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);培养至第25代时，P25染毒组8-OHdG及MDA含量升高更为明显，与同代对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.培养至第15代时，与同代对照组相比，P15染毒组抗氧化物酶CAT、SOD、GSH-Px酶活性及GSH含量降低，差异具有统计学意义(P＜0.05);培养至第25代时，与同代对照组相比，P25染毒组CAT、SOD、GSH-Px酶活性及GSH含量下降更为明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.培养至第10代时，细胞内γ-GCS酶活性开始出现下降，随着染毒时间的延长，γ-GCS酶活性下降更为明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.实时荧光定量PCR结果显示，培养至第10代时，P10染毒组γ-GCS催化亚基GCLC mRNA表达水平降至同代对照组的84％(P＜0.05);培养至第15代时，P15染毒组GCLC mRNA表达水平降至同代对照组的69％(P＜0.05);培养至第25代时，P25染毒组GCLC mRNA表达水平降至同代对照组的66％，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　5.Western Blot结果显示，培养至第10代时，P10染毒组GCLC蛋白表达水平降至同代对照组的89％(P＜0.05);培养至第15代时，P15染毒组GCLC蛋白表达水平降至同代对照组的78％(P＜0.05);培养至第25代时，P25染毒组GCLC蛋白表达水平降至同代对照组的65％，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　6.培养至第10代时，P10染毒组p-GCLC蛋白表达水平为同代对照组的1.2倍(P＜0.05);P15染毒组p-GCLC蛋白表达水平为同代对照组的1.5倍(P＜0.05);P25染毒组p-GCLC蛋白表达水平为同代对照组的2.9倍，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　7.培养至第10代时，P10染毒组细胞PP2A酶活性下降至同代对照组的91％(P＜0.05);培养至第15、25代时，P15、P25染毒组细胞PP2A酶活性分别下降至同代对照组的75％和69％，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
　　8.直线相关分析结果显示，GCLC蛋白表达水平与8-OHdG含量之间呈负相关关系（r=-0.901，P＜0.01）;GCLC蛋白表达水平与MDA含量之间呈负相关关系（r=-0.936，P＜0.01）。PP2A酶活性与GCLC mRNA表达水平之间呈正相关关系（r=0.983，P＜0.05）;PP2A酶活性与GCLC蛋白表达水平之间呈正相关关系（r=0.878，P＜0.01）。
　　结论：1.MC-LR低剂量长期染毒诱导人肝细胞WRL68发生恶性转化过程中伴随细胞内PP2A酶活性持续降低，γ-GCS关键亚基GCLC蛋白磷酸化水平持续增加，引起GCLC的mRNA表达、蛋白表达水平下调，γ-GCS酶活性下降。
　　2.微囊藻毒素-LR诱导肝细胞恶性转化过程中，GSH含量及抗氧化酶CAT、SOD、GSH-Px酶活性下降，MDA和8-OHdG含量逐渐升高，引起脂质和DNA氧化损伤。

目录

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个人简历

论文缩写词汇中英对照表

摘要

前言

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．2 MC-LR诱导细胞恶性转化过程中MDA含量的改变

2．3 MC-LR诱导细胞恶性转化过程中CAT活性的改变

2．5 MC-LR诱导细胞恶性转化过程中GSH-Px酶活性的改变

2．6 MC-LR诱导细胞恶性转化过程中GSH含量的改变

2．8 MC-LR诱导WRL68细胞恶性转化过程中GCLC mRNA表达水平的改变

2．9 MC-LR诱导WRL68细胞恶性转化过程中GCLC总蛋白及磷酸化GCLC蛋白表达水平的改变

2．10 MC-LR诱导WRL68细胞恶性转化过程中PP2A酶活性的改变

3 讨论

3．1 MC-LR诱导细胞恶性转化过程中氧化损伤产物8-OHdG、MDA含量的改变

3．2 MC-LR诱导细胞恶性转化过程中抗氧化物CAT、SOD、GSH-Px酶活性以及GSH含量的改变

3．3 MC-LR诱导细胞恶性转化过程中γ-GCS酶活性、GCLC mRNA表达、蛋白表达水平的改变

3．4 MC-LR诱导细胞恶性转化过程中PP2A酶活性、GCLC磷酸化蛋白水平的改变

结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文