寨卡病毒NS5蛋白M114V突变的生物学功能研究

摘要

寨卡病毒(Zika virus)是一种再出现的虫媒病毒，属于黄病毒科黄病毒属。寨卡病毒最早于1947年在乌干达寨卡森林的恒河猴血液中分离得到，因此得名。2007年，寨卡病毒在非洲和亚洲地区出现局部性流行，但其并未导致严重疾病，且感染病例报告数少于20次。然而，自2015年以来，巴西、委内瑞拉等拉美地区接连发生寨卡病毒暴发流行，发病人数高达200万，并且导致了严重的并发症，包括感染孕妇的胎儿先天性畸形(小头畸形(Microcephaly)和胎儿死亡）以及成人格林巴利综合征，引起全世界的广泛关注。 寨卡病毒自发现60余年以来，只有少数病例被零星报道，且临床症状轻微，所以一直未受重视。寨卡患者的临床症状与同为蚊媒传播的登革热类似，其主要表现为发热、斑丘疹、关节疼痛、结膜炎等，绝大多数患者经对症治疗后可在七天内恢复健康。而此次小头畸形等严重神经系统症状的出现，已经超出了对虫媒黄病毒的固有认知，尽快阐明寨卡病毒致病机制迫在眉睫。 系统进化分析显示，寨卡病毒分为非洲世系和亚洲世系。2015-2016年间，在美洲地区暴发大流行且引起严重疾病的寨卡病毒株属于亚洲世系。寨卡病毒的大规模暴发可能是由许多潜在机制驱动造成的，包括因遗传变化导致其获得较强的神经毒力和蚊虫感染能力。最近有研究表明寨卡病毒PrM蛋白上的单个氨基酸丝氨酸取代天冬酰胺，可增强其致胎鼠小头畸形的能力和对神经细胞的感染能力，这在分子水平上阐明了寨卡病毒在进化过程中神经毒力逐渐增强的机制。也有报道称，寨卡病毒NS1非结构蛋白的A188V突变可增强病毒在蚊虫体内的复制能力，并影响其介导Ⅰ型干扰素(IFN-β)产生的能力，从而增强寨卡病毒对宿主的致病性。我们的研究发现寨卡病毒非结构蛋白NS5上的第114位氨基酸在2015年以前高度保守，之后则由甲硫氨酸(M)突变成了缬氨酸(V)。进一步研究发现该位点的单个氨基酸替代(M114V)能增强寨卡病毒穿越血胎屏障的能力，同时可降低病毒对Ⅰ型干扰素的拮抗能力。进一步阐明寨卡病毒在不断的进化过程中，逐渐获得了对宿主的致病毒性和高适应性，从而为解释美洲大流行提供了重要依据。 本研究主要分为以下两部分。 一、不同分离株的寨卡病毒与Ⅰ型干扰素反应相互作用比较 为了明确不同年代寨卡分离株对Ⅰ型干扰素的敏感性是否存在差异，选取了五株分离自不同时期的寨卡病毒进行了系统比较。首先，对其IFN-α敏感性进行测定。 结果：显示，与早期寨卡分离株相比，当前寨卡流行株的IFN-α敏感性更弱。其中寨卡病毒委内瑞拉株(VEN/2016)对IFN-α的敏感性最弱，寨卡病毒柬埔寨株(CAM/2010)对IFN-α的敏感性最强。体内实验结果表明，VEN/2016的乳鼠神经毒力显著强于CAM/2010;VEN/2016感染免疫健全小鼠后，血清中的病毒载量明显高于CAM/2010感染的小鼠;对于Ⅰ型干扰素受体缺陷型小鼠，两株寨卡病毒感染导致的病毒血症并无显著性差异。由此推测，两株寨卡病毒之间存在的毒力差异可能与其对Ⅰ型干扰素的敏感性不同密切相关。进一步实验结果显示，VEN/2016感染抑制了宿主细胞STAT2的表达，从而导致磷酸化的STAT2显著降低，抑制了Ⅰ型干扰素信号通路，而且VEN/2016拮抗Ⅰ型干扰素信号通路的能力显著强于CAM/2010。上述结果表明，与寨卡早期分离株相比，寨卡当前流行株具有更强的拮抗Ⅰ型干扰素的能力。 二、重组突变病毒M114V与野生型病毒体内外模型的评价 寨卡病毒的非结构蛋白NS5是其编码的最大蛋白，其N端的甲基转移酶MTase的2'-O甲基化可以使病毒逃逸天然免疫的监测。此外，已有研究表明寨卡病毒NS5蛋白能够通过蛋白酶体降解人源性的STAT2，阻碍下游抗病毒蛋白的产生。为阐明不同年代寨卡分离株对IFN-α敏感性不同的机制，对包括VEN/2016以及CAM/2010在内的45株寨卡病毒分离株编码区的氨基酸序列进行了系统进化分析，发现寨卡病毒NS5蛋白的第114位氨基酸在2015年以前高度保守，2015年以后由甲硫氨酸(M)进化为缬氨酸(V)。推测寨卡病毒该位点的突变影响了寨卡病毒的致病性。通过反向遗传学技术，将NS5蛋白上的氨基酸差异位点引入CAM/2010的全长感染性克隆，并通过转染细胞的手段获得了突变病毒M114V。进一步在体内外模型上对突变株病毒和野生型病毒(WT)进行了比较。生物学特性方面，两株病毒的蚀斑形态、在不同细胞系上的生长曲线及E蛋白表达都不存在显著性差异。WT在免疫健全129小鼠的血症和脏器嗜性方面均强于M114V;在Ⅰ型干扰素受体缺陷型A129小鼠体内，两种病毒的病毒血症、脏器嗜性、体重和死亡率无显著性差异。以上实验结果表明，WT与M114V的体内致病性差异与Ⅰ型干扰素有关。进一步研究发现，与M114V相比，WT显著抑制了Ⅰ型干扰素信号分子STAT2的表达，从而抑制了干扰素下游抗病毒蛋白的作用，最终导致WT对IFN-α的敏感性弱于M114V。免疫健全的孕鼠感染模型中，M114V在外周血的复制能力弱于WT，但对胎盘和胎脑的组织嗜性更强。进一步研究结果显示，M114V在人和鼠的神经细胞系的复制能力均强于WT。总体而言，M114V较之WT，感染正常小鼠后，可更快地在外周血中被清除，但M114V更易穿越血胎屏障进入胎盘，而且一旦侵袭神经组织，其复制能力则强于WT。 综上所述，本研究发现寨卡当前流行株和早期分离株对IFN-α的敏感性不同，通过生物信息学推测造成这种现象的原因：NS5蛋白的第114位氨基酸由甲硫氨酸(M)到缬氨酸(V)的替代可能导致了病毒毒力和致病能力的改变。通过体内外模型分析比较了突变病毒和野生型病毒拮抗宿主Ⅰ型干扰素系统的能力，两种病毒对小鼠的致病性及其在神经组织中的复制能力，发现寨卡病毒流行进化过程中，非结构蛋白NS5第114位氨基酸由M到V的改变增强了寨卡病毒穿越血胎屏障的能力和对胎鼠的致病性，这项研究对于深刻理解寨卡病毒的暴发和毒力进化具有重要意义，同时也为后续抗寨卡病毒药物和疫苗的研发奠定了基础。