钙敏感受体在前列腺癌细胞耐药和EMT中作用的研究

摘要

前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是欧美国家男性中常见的恶性肿瘤，其发病率在全球分布不平衡，在欧洲和美国等许多国家中，占男性癌症死因第二名。国家的发病率虽然低于西方许多的国家，但是近年来随着人口逐渐老龄化、生活方式发生巨大的改变等诸多因素，发病率呈明显上升趋势。影响前列腺癌发病原因十分复杂，和大多数的恶性肿瘤一样，染色体畸形变起了重要的作用，是一个涉及多基因的过程，同时也与环境因素有密切的关系，如饮食习惯、环境污染等。此外，前列腺癌的发生和发展与种族、地区、宗教信仰、可能也存在一定的关联。在前列腺癌的诊治方面，由于前列腺癌开始确诊时多为雄激素依赖性，所以雄激素阻断疗法并配合化疗药物治疗是一种常见有效的治疗方法，化疗药物治疗是恶性肿瘤治疗最重要的手段之一，然而，随着肿瘤细胞对化疗药物产生耐药，以及肿瘤细胞的转移，将导致治疗困难，以及治疗效果不佳，使患者预后不良，最终导致治疗失败。
　　钙敏感受体(Calcium-sensing receptor;CaSR)，作为GPCRs中的一员，属于GPCRs中的C家族。其在神经系统、心血管系统、胃肠道、肾脏及骨组织中都有广泛的分布，CaSR的表达主要受到细胞外Ca2+浓度的调节，CaSR的作用主要表现在调节细胞钙稳态、渗透平衡和水的吸收等方面。CaSR作为多功能调节器，不仅能作为离子通道调节细胞渗透压等，还能参与并能调节多种细胞生长、分化、凋亡细胞分泌等高级细胞活动，逐渐成为疾病诊断、预防以及治疗的潜靶点。钙敏感受体表达水平与多种疾病包括某些肿瘤密切相关。大量文献证明CaSR在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等癌症中呈高表达，有一定的促进某些肿瘤的发生和发展的作用，并且能参与肿瘤细胞增生、血管形成和肿瘤细胞转移等一系列致癌过程。
　　上皮细胞-间充质转化(EMT)，是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥了重要作用，其主要的特征有细胞黏附分子（如E-钙黏蛋白）表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白(Vimentin)为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等。通过EMT作用，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁徙和侵害能力的重要生物学过程。但是，就目前的研究结果而言，CaSR对前列腺癌细胞的迁移、侵袭影响，以及与EMT转化和对化疗药物紫杉醇的增效作用尚不清楚。
　　实验假说：
　　CaSR过表达与前列腺细胞耐药形成相关。通过干扰前列腺癌耐药细胞中CaSR的表达，提高对紫杉醇类化疗药物的敏感性，同时细胞发生EMT-MET转化，改变增殖、迁移、凋亡等多种细胞生命活动。
　　目的：
　　本课题应用了体外实验模型，研究钙敏感受体对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，以及对前列腺癌细胞化疗敏感性的影响。研究结果将为前列腺癌的临床治疗提供新的潜在的治疗靶点和诊断标记物。
　　方法：
　　应用实时荧光定量PCR检测前列腺癌亲本及耐药细胞中CaSR的表达，确定其在不同的细胞中的表达差异;采用siRNA瞬时转染技术，下调前列腺癌耐药细胞中CaSR的表达，并使用RT-PCR和western blot验证其表达的改变;通过western blotting检测前列腺癌耐药细胞中CaSR表达改变前后EMT相关基因的表达水平;应用划痕实验和transwell侵袭小室检测下调CaSR表达后对前列腺耐药细胞系迁移和侵袭能力的影响;应用克隆形成实验检测抑制CaSR表达后对前列腺耐药细胞系克隆形成能力的影响;应用MTS的方法在前列腺癌耐药细胞系中检测转染siRNA前后前列腺癌耐药细胞对紫杉醇敏感性的改变;通过western blotting检测前列腺癌耐药细胞中CaSR表达改变前后凋亡相关基因的表达水平。
　　结果：
　　通过RT-PCR和Western blotting结果，证实CaSR在前列腺癌亲本细胞中表达量明显低于耐药细胞，提示亲本及耐药细胞间特征差异可能与CaSR的表达有关。应用siRNA瞬时转染，下调耐药细胞中CaSR的表达，结果显示在耐药细胞株中低表达E-cadherin经瞬时转染后其表达明显升高，而原本高表达Vimentin、β-catenin、Snail的表达下降。划痕实验和Transwell侵袭实验结果表明，CaSR表达降低后前列腺耐药细胞的迁移能力下降。同时，细胞克隆形成实验证明了CaSR降低后可以抑制细胞株的增殖和凋亡能力。siRNA转染后紫杉醇处理组与阴性对照相比，前者的抑制作用更加明显，表明前列腺耐药细胞中下调CaSR的表达使其对紫杉醇敏感性增加。综上所述，钙敏感受体有望成为前列腺癌治疗以及缓解药物抵抗作用的新靶点。
　　结论：
　　通过下调CaSR的表达可抑制前列腺癌细胞增殖和迁移、增加细胞凋亡，并且CaSR表达的降低提高前列腺癌耐药细胞对紫杉醇的敏感性。

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摘要

前言

实验材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

3 统计学分析

实验结果

1．前列腺癌亲本细胞及耐药细胞中CaSR及EMT相关蛋白的表达

2．应用siRNA技术下调CaSR在前列腺癌亲本和耐药细胞中的表达

3．前列腺癌耐药细胞中下调CaSR的表达诱导MET转化

4．下调CaSR的表达降低前列腺癌耐药细胞的侵袭和迁移能力

5．下调CaSR的表达抑制前列腺癌耐药细胞的增殖

6．下调前列腺癌耐药细胞中CaSR表达减少其克隆形成能力

7．下调CaSR的表达，前列腺癌耐药细胞对紫杉醇的敏感性增加

8．前列腺癌耐药细胞中下调CaSR表达增加凋亡相关分子的表达

讨论

全文小结

参考文献

综述

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文