cAMP/PKA/CREB信号通路在缺氧预处理逆转丙泊酚致发育期大鼠海马神经元毒性中的作用

摘要

本文主要分为以下几个部分:
　　第一部分 缺氧预处理对丙泊酚诱导发育期大鼠海马神经毒性的逆转作用
　　目的:通过建立缺氧预处理模型，观察缺氧预处理对丙泊酚诱导的发育期大鼠海马神经损伤的影响。
　　方法:50只7天SD大鼠随机分为生理盐水组（N组）、脂肪乳剂组(F组)、缺氧预处理组（H组）、丙泊酚组（P组）、缺氧预处理+丙泊酚注射组(HP组)，每组10只。P组大鼠先注射50 mg/kg丙泊酚，待大鼠有体动反应后，再给予50 mg/kg，总量为100 mg/kg;H组大鼠被置于充入8％ O2+92％N2混合气体的密封罐中，持续10分钟，然后置于空气中10分钟，如此循环，共5个循环，空气中恢复2小时;N组、F组分别给予100μl的生理盐水或脂肪乳剂腹腔注射;缺氧预处理+丙泊酚注射组（HP组），先给予缺氧预处理（同H组）后再给与腹腔丙泊酚注射（同P组）。HE染色观察海马区神经细胞形态，透射电镜观察海马神经元形态结构，TUNEL染色观察海马神经细胞凋亡情况，Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3表达情况，免疫组化检测凋亡相关蛋白活化的cleaved-caspase-3表达情况。
　　结果:HE结果显示，与N组比较，P组锥体细胞排列紊乱，胞体缩小，核固缩，F组和H组无明显差异;与P组比较，HP组锥形细胞排列较整齐，胞浆较丰富，核较清楚。电镜结果显示，与N组比较，P组染色质边集，核固缩，核膜内陷，F组和H组无明显差异;与P组比较，HP组染色质略有减少，染色质密度较均匀。TUNEL结果显示，与N组比较，P组TUNEL阳性细胞的数量升高(P＜0.05)，F组和H组无明显差异;与P组比较，HP组的TUNEL阳性细胞数量减少(P＜0.05)。Western blot结果显示，与N组比较，P组Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05）， Bax蛋白和cleaved-caspase-3蛋白表达升高(P＜0.05)，F组和H组无明显差异;与P组比较，HP组Bcl-2蛋白表达升高（P＜0.05），同时Bax蛋白和cleaved-caspase-3蛋白表达降低(P＜0.05)。免疫组化结果显示，与N组比较，P组cleaved-caspase-3蛋白表达升高(P＜0.05)，F组和H组无明显差异;与P组比较，cleaved-caspase-3蛋白表达降低(P＜0.05)。
　　结论:1.丙泊酚对发育期大鼠海马神经细胞具有损伤作用，诱导海马神经细胞凋亡。
　　2.缺氧预处理能够减轻丙泊酚对发育期大鼠海马神经细胞的损伤作用，抑制其诱导的海马神经细胞凋亡。
　　第二部分 cAMP/PKA/CREB信号通路在缺氧预处理对丙泊酚毒性逆转中的作用
　　目的:研究cAMP/PKA/CREB信号通路在缺氧预处理逆转丙泊酚毒性中的作用，阐明cAMP/PKA/CREB信号通路是否是缺氧预处理逆转丙泊酚毒性的作用机制之一。
　　方法:70只7天SD大鼠随机分为生理盐水组（N组）、丙泊酚组(P组)、缺氧预处理+丙泊酚注射组（HP组）、缺氧预处理+丙泊酚+H89组(HPH89组)、丙泊酚+Sp-cAMP组(PSP组)、生理盐水侧脑室注射组(NI组)、DMSO侧脑室注射组（DI组），每组10只。P组大鼠先注射50 mg/kg丙泊酚，待大鼠有体动反应后，再给予50 mg/kg，总量为100 mg/kg;缺氧预处理+丙泊酚注射组（HP组）先给予缺氧预处理（将幼鼠置于充入浓度为8％ O2+92％ N2混合气体的密封罐体内，持续10分钟，然后置于空气中恢复10分钟，共给予5个循环，在空气中恢复2小时）后再给与腹腔丙泊酚注射（同P组）;缺氧预处理+丙泊酚+H89组（HPH89组）先给予溶于DMSO的PKA抑制剂H89侧脑室注射，待恢复30min后，行缺氧预处理与丙泊酚注射（同HP组）;丙泊酚+Sp-cAMP组（PSP组）先给与溶于生理盐水的PKA激动剂Sp-cAMP侧脑室注射，待恢复30min后，给予丙泊酚注射（同P组）;N组分别给予100μl的生理盐水腹腔注射;生理盐水+侧脑室注射组（NI组）和DMSO+侧脑室注射组(DI组)，分别侧脑室注射相同体积浓度的NS和DMSO。HE染色观察海马区神经细胞形态，透射电镜观察神经元形态结构，ELSIA检测海马组织cAMP含量，Western blot检测通路和凋亡相关蛋白PKA、pCREB、Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3-3蛋白表达情况，免疫组化检测通路蛋白PKA和pCREB表达情况。
　　结果:HE结果显示，与N组比较，P组锥体细胞排列紊乱，胞体缩小，核固缩;与P组比较，HP组和PSP组锥形细胞排列较整齐，胞浆较丰富，核较清楚，与HP组比较，HPH89组排列紊乱，胞体缩小，核固缩。电镜结果显示，与N组比较，P组染色质边集，核固缩，核膜内陷;与P组比较，HP组和PSP组染色质略有减少，染色质密度较均匀;与HP组比较，HPH89组:染色质边集，核固缩，核膜内陷。ELSIA结果显示,与N组比较，P组cAMP含量下降(P＜0.05);与P组比较，HP组和PSP组cAMP含量升高P＜0.05）。Western blot结果显示，与N组比较，P组Bcl-2蛋白、PKA蛋白和pCREB蛋白表达降低(P＜0.05)，而Bax蛋白、cleaved-caspase-3蛋白表达升高(P＜0.05);与P组比较，HP组Bcl-2蛋白、PKA蛋白和pCREB蛋白表达升高(P＜0.05)，同时Bax蛋白和cleaved-caspase-3蛋白表达降低(P＜0.05)，PSP组Bcl-2蛋白、PKA蛋白和pCREB蛋白表达升高(P＜0.05)，而cleaved-caspase-3蛋白表达降低(P＜0.05);与HP组比较，HPH89组Bcl-2蛋白、PKA蛋白和pCREB蛋白表达下降(P＜0.05)，同时cleaved-caspase-3蛋白表达升高(P＜0.05)。免疫组化结果显示，与N组比较，免疫组化结果显示P组PKA蛋白和pCREB蛋白表达降低(P＜0.05)，与P组比较，HP组和PSP组PKA蛋白和pCREB蛋白表达升高(P＜0.05)，与HP组比较，HPH89组PKA蛋白和pCREB蛋白表达下降(P＜0.05)。
　　结论:1.丙泊酚对发育期大鼠海马神经细胞具有损伤作用，诱导海马神经细胞凋亡与cAMP/PKA/CREB信号通路下调相关。
　　2.缺氧预处理能够减轻丙泊酚对发育期大鼠海马神经细胞的损伤作用，抑制其诱导的海马神经细胞凋亡与缺氧预处理抑制丙泊酚诱导的cAMP/PKA/CREB信号通路下调相关。
　　第三部分 GLUT1、GLUT3及Drp1、MFN2在缺氧预处理逆转丙泊酚神经毒性中表达水平的变化
　　目的:研究缺氧预处理逆转丙泊酚神经毒性过程中，GLUT1、GLUT3及线粒体Drp1、MFN2蛋白表达变化，探究缺氧预处理逆转丙泊酚神经毒性与糖转运及线粒体分裂融合的关系，进一步探索其机制。
　　方法:50只7天SD大鼠随机分为生理盐水组（N组）、脂肪乳剂组(F组)、缺氧预处理组（H组）、丙泊酚组（P组）、缺氧预处理+丙泊酚注射组（HP组），每组10只。P组大鼠先注射50 mg/kg丙泊酚，待大鼠有体动反应后，再给予50 mg/kg，总量为100 mg/kg;H组大鼠被置于充入8％O2+92％Na混合气体的密封罐中，持续10分钟，然后置于空气中10分钟，如此循环，共5个循环，空气中恢复2小时;N组、F组分别给予100μl的生理盐水或脂肪乳剂腹腔注射;缺氧预处理+丙泊酚注射组（HP组），先给予缺氧预处理（同H组）后再给与腹腔丙泊酚注射（同P组）。透射电镜观察神经元线粒体形态结构，ATP试剂盒检测海马组织ATP含量，Western blot检测糖转运和线粒体分裂融合相关蛋白GLUT1、GLUT3、pDrp1、Drp1和MFN2表达情况，免疫组化检测糖转运相关蛋白GLUT1和GLUT3表达情况。
　　结果:电镜结果显示，与N组比较，P组线粒体肿胀，部分线粒体内膜破裂、嵴疏松溶解，甚至嵴断裂，基质密度降低，F组和H组无明显差异;与P组比较，HP组线粒体有轻微肿胀，线粒体嵴较完整，基质密度较均匀。ATP结果显示，与N组比较，P组ATP含量下降(P＜0.05);与P组比较，HP组ATP含量增高(P＜0.05)。Western blot结果显示，与N组比较，P组GLUT3蛋白和pDrp1蛋白表达降低(P＜0.05)，H组和HP组GLUT1和GLUT3蛋白明显增高(P＜0.05);与P组比较，HP组pDrp1、GLUT1和GLUT3蛋白表达明显升高（P＜0.05）。免疫组化结果显示，与N组比较，P组GLUT3蛋白表达下降(P＜0.05);与P组比较，HP组GLUT1和GLUT3蛋白表达明显升高(P＜0.05)。
　　结论:1.丙泊酚对发育期大鼠海马神经细胞具有损伤作用，诱导海马神经细胞凋亡，其机制可能与线粒体分裂过度及GLUT3下降有关。
　　2.缺氧预处理能够减轻丙泊酚对发育期大鼠海马神经细胞的损伤作用，抑制其诱导的海马神经细胞凋亡，其机制可能与抑制线粒体过度分裂及促进GLUT3表达有关。

目录

声明

个人简历

摘要

第一部分 缺氧预处理对丙泊酚诱导发育期大鼠海马神经毒性的逆转作用

前言

1 实验材料及仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

结论

参考文献

第二部分 cAMP／PKA／CREB信号通路在缺氧预处理逆转丙泊酚毒性中的作用

前言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

结论

参考文献

第三部分 GLUT1、GLUT3及Drp1、MFN2在缺氧预处理逆转丙泊酚神经毒性中表达水平的变化

前言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

结论

参考文献

小结

附录

综述 缺氧预处理的神经保护作用和葡萄糖转运蛋白研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文