TLR9-MyD88-TRAF6-IRF5信号通路在系统性红斑狼疮发生发展中的作用与机制的初步研究

摘要

目的:
　　为了初步阐明TLR9-MyD88-TRAF6-IRF5信号通路及其信号分子在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）发生与发展中的作用与机制。
　　方法:
　　按照SLEDAI评分，将38例SLE患者分为非活动期组（21例）、活动期组（17例）。应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测两组SLE患者及19例健康对照外周血单个核细胞(PBMC)中Toll样受体9（TLR9）、接头蛋白髓系分化蛋白88(MyD88)、肿瘤坏死因子相关受体因子6（TRAF6）、干扰素调节因子5(IRF5)mRNA表达水平，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上述两组SLE患者及19例健康对照血清中干扰素α(IFN-α)及白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）的水平。采用免疫磁珠分离法分离4例SLE患者及4例健康对照外周血B淋巴细胞，培养3天后传代，将细胞悬液平均分到两个孔中，分别标记阻滞剂干预组及空白对照组。在阻滞剂干预组中加入TLR9阻滞剂，空白对照组中加入TLR9阻滞剂的空白对照制剂。继续培养24小时，采用RT-qPCR检测两组B细胞上TLR9、MyD88、TRAF6、IRF5mRNA相对表达量，并使用ELISA法检测两组培养上清中IL-6、IL-10的水平。
　　结果:
　　1.外周血PBMC中TLR9-MyD88-TRAF6-IRF5信号通路各信号分子的表达
　　(1)外周血PBMC中，TLR9、TRAF6、IRF5表达量在活动期组均较非活动期组、健康对照组高，非活动期组均较健康对照组高，各组间差异均有统计学意义（均p＜0.05）。非活动期组MyD88表达量较健康对照组高，差异有统计学意义(p＜0.05），活动期组MyD88表达量较健康对照组高，但差异无统计学意义(p＞0.05)。SLE活动期组血清中IL-6、IL-10表达量均较非活动期组、健康对照组高，非活动期组均较健康对照组高，各组间差异均有统计学意义（均p＜0.05）;SLE活动期组血清中IFN-α表达量均较非活动期组及健康对照组高，差异均有统计学意义(p＜0.05)，非活动期组与健康对照组间差异无统计学意义(p＞0.5)。
　　(2)TLR9-MyD88-TRAF6-IRF5信号通路中各信号分子与SLE部分活动指标的相关性分析
　　SLE患者组PBMC中TLR9的表达量与MyD88、TRAF6、IRF5、IFN-α、IL-6、IL-10、dsDNA、SLEDAI均呈正相关，与补体C3、补体C4的表达量均呈负相关，差异均有统计学意义（均p＜0.05）。MyD88与TRAF6、IRF5、IFN-α、IL-6、IL-10、SLEDAI、补体C3、补体C4、dsDNA均无相关性(均p＞0.05)。TRAF6与IRF5、IFN-α、SLEDAI、dsDNA均呈正相关，差异均有统计学意义（均p＜0.05）;与IL-6、IL-10、补体C3、补体C4均无相关性，差异均无统计学意义（均p＞0.05）。IRF5与IFN-α、IL-6、IL-10、SLEDAI、dsDNA均呈正相关，与补体C3呈负相关，差异均有统计学意义（均p＜0.05）;与补体C4无相关，差异无统计学意义(p＞0.05)。
　　(3)TLR9-MyD88-TRAF6-IRF5信号通路中各信号分子与SLE相关临床表现的统计分析
　　SLE患者组中，TLR9、TRAF6、IRF5的表达量在合并有关节炎患者较无合并关节炎患者高，差异均有统计学意义(均p＜0.05)。而MyD88的表达量在合并关节炎患者较无合并关节炎患者低，差异有统计学意义(p＜0.05)。TLR9、TRAF6、IRF5的表达量在有面部红斑的患者与无面部红斑的患者间差异均无统计学意义（均p＞0.05），MyD88的表达量在有面部红斑的患者较无面部红斑的患者低，差异有统计学意义(p＜0.05）。
　　2.TLR9阻滞剂对体外培养的外周血B淋巴细胞上TLR9-MyD88-TRAF6-IRF5信号通路各信号分子及下游因子的影响
　　(1)磁珠分离外周血B淋巴细胞后，流式细胞术检测B细胞纯度大于95％。
　　(2)体外培养外周血B淋巴细胞中，SLE患者组TLR9、MyD88、TRAF6、IRF5表达量均较健康对照组高，差异均有统计学意义（均p＜0.05）。
　　(3)体外培养外周血B淋巴细胞中，TLR9阻滞剂干预组中TLR9、MyD88、TRAF6、IRF5的表达量均较空白对照组低，差异均有统计学意义(均p＜0.05)。对于同一信号分子，其在健康对照组中的空白对照的表达量与TLR9阻滞剂干预后的表达量之间的差值均较SLE组的差值大，差异均有统计学意义（均p＜0.05）。
　　(4)SLE患者B细胞培养上清中IL-6、IL-10的表达量较健康对照组低，差异均有统计学意义。对于同一信号分子，其在健康对照组中的空白对照的表达量与TLR9阻滞剂干预后的表达量之间的差值均较SLE组的差值大，差异均有统计学意义（均p＜0.05）。
　　结论:
　　1.TLR9-MyD88-TRAF6-IRF5信号通路可能与SLE的发病及疾病活动具有相关性，该通路信号分子的表达水平有可能成为疾病活动的判断指标;
　　2.SLE患者B淋巴细胞上TLR9-MyD88-TRAF6-IRF5信号通路可能存在异常耐受。

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摘要

前言

第一部分 TLR9-MyD88-TRAF6-IRF5信号通路各信号分子在外周血单个核细胞的表达及与SLE活动指标的相关性研究

1．材料和仪器

2 实验方法

3．统计学处理

4．结果

5．讨论

6．结论

第二部分 TLR9-MyD88-TRAF6-IRF5信号通路各分子在外周血B淋巴细胞的表达与意义

1．材料和仪器

2．实验方法

3．统计学处理

4．结果

5．讨论

6．结论

创新性

展望

参考文献

附录

综述 TLR9在系统性红斑狼疮作用机制的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文