C-jun基因沉默对鼻咽癌裸鼠成瘤及血管生成影响的实验研究

摘要

目的:研究慢病毒介导的c-jun基因沉默对人鼻咽癌放射抗拒系CNE-2R细胞裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响，并探讨其可能的作用机制，为鼻咽癌基础研究及临床治疗提供新思路和实验依据。
　　方法:根据我们前期的实验方法，利用携带shRAN的慢病毒载体感染CNE-2R细胞以沉默c-jun基因，构建稳定c-jun基因沉默的CNE-2R细胞株c-jun-shRNA-CNE-2R细胞组（c-jun-shRNA组），病毒干扰阴性对照NC-shRNA-CNE-2R细胞组(NC组)，以及未作任何处理CNE-2R细胞为空白对照组（Control组），qRT-PCR及Western blot实验检测c-jun基因沉默效果及三组细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表达水平。并应用三组细胞分别在15只裸鼠（雄性，4-6周龄，每组5只）右侧腹股沟构建裸鼠皮下移植瘤模型。连续6周观察三组细胞裸鼠皮下种植瘤生长情况，并使用游标卡尺每周定时测量移植瘤的长径(a)和短径(b)，记录体积变化情况并绘制生长曲线，比较三组裸鼠移植瘤体积;选取第二、三、四、五、六周5个时间点行重复测量方差分析比较三组移植瘤分组效应、时间效应和分组×时间效应的统计量;6周末终止观察并处死所有裸鼠，剥离三组裸鼠移植瘤并称重进行统计分析;移植瘤分组包埋蜡块切片，免疫组化化学法检测移植瘤组织c-jun、VEGF、CD34的表达，并根据CD34表达情况检测组织内微血管密度(microvessel density，MVD)改变。分析c-jun基因沉默对鼻咽癌生长及血管生成的影响。采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析。实验数据以均数±标准差（(-x)±s）表示，两组间均数比较用t检验，多组间比较采用方差分析(ANOVA)，肿瘤体积生长比较采用重复测量方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:(1)对人鼻咽癌放射抗拒性细胞CNE-2R慢病毒转染成功，qRT-PCR、western blot结果验证CNE-2R细胞中c-jun基因沉默效果好。(2)qRT-PCR、westem blot结果显示c-jun基因沉默致CNE-2R细胞VEGF表达下降。(3)鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型成功建立，接种细胞1周后，所有实验裸鼠移植部位触及肿块，成瘤率达100％。(4)在6周的连续观察内，第一、二周内三组移植瘤生长体积明显差异无统计学意义。第三、第四、第五、第六周观察期c-jun-shRNA组裸鼠移植瘤体积较NC组和Control组增长缓慢，c-jun-shRNA组移植瘤体积明显小于NC组与Control组(均P＜0.05)，而NC组与Control组之间比较无统计学差异(P＞0.05)。第6周末c-jun-shRNA组种植瘤体积为(720.85±72.10)mm3，NC组体积(1196.81±90.69)mm3，Control组(1203.76±100.42)mm3。重复测量方差分析显示，分组效应、时间效应和分组×时间效应的统计量分别为F分组=52.276、P分组=0.001，F时间=89.437、P时间=0.000，F分组×时间=25.187、P分组×时间=0.001，结果分组效应、时间效应和分组×时间效应均有统计学意义。分组效应说明c-jun-shRNA组裸鼠移植瘤明显小于Control及NC组，时间效应说明三组移植瘤的体积均随时间的延长而增长，分组×时间效应具有统计学差异说明分组和时间具有交叉作用;从移植瘤体积的增长速度中可以发现，c-jun-shRNA组随时间延长移植瘤体积增长的幅度比Control及NC组增长的幅度明显减少。(5)处死裸鼠剥离移植瘤并称重，三组质量分别为:c-jun-shRNA组为(0.423±0.040)g，NC组(0.798±0.081)g，Control组质量为(0.825±0.053)g，cjun-shRNA组移植瘤质量显著小于NC及Control组（均P＜0.05）;而NC组与Control组之间比较无统计学差异（P＞0.05）。(6)免疫组化检测结果显示，c-jun-shRNA组移植瘤c-jun、VEGF、CD34蛋白较NC组及Control组表达蛋白明显下降P＜0.05）。(7)根据移植瘤切片CD34表达对组织内微血管密度(MVD)分析，结果显示c-jun-shRNA组MVD为(11.69±3.30)分级为1-2级;NC组MVD为(32.56±7.33)，Control组MVD为(35.45±4.87)，分级均为3-4级，c-jun-shRNA组MVD计数及VEGF表达均明显低于NC组和Control组(均P＜0.05)。
　　结论:(1)c-jun基因沉默可下调鼻咽癌放射抗拒细胞CNE-2R中VEGF的表达。
　　(2)c-jun基因沉默抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生长及微血管生成。
　　(3)c-jun基因沉默通过下调VEGF抑制鼻咽癌移植瘤生长及微血管生成。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

第一部分 慢病毒shRNA载体介导人鼻咽癌放射抗拒细胞CNE-2R中c-jun基因沉默及其对VEGF表达的影响

引言

1．1 材料

1．1．1 细胞株及载体

1．1．2 主要试剂及仪器

1．2 实验方法

1．2．1 试剂配制

1．2．2 细胞复苏

1．2．3 细胞消化、传代、计数

1．2．4 细胞冻存

1．2．5 总RNA抽提、浓度、纯度测定及质量检测

1．2．6 qRT-PCR实验验证c-jun基因及VEGF的表达

1．2．7 Western blot实验检测c-jun及VEGF蛋白的表达

1．2．8 重组慢病毒载体制备

1．2．9 CNE-2R细胞转染

1．2．10 数据统计分析方法

1．3 结果

1．3．1 荧光显微镜下观察转染的细胞

1．3．3 Western blot实验检测CNE-2R细胞转染后c-jun基因的表达情况

1．3．4 体外细胞实验检测c-jun基因沉默对CNE-2R细胞中VEGF表达的影响

1．4 讨论

1．5 小结

第二部分 c-jun基因沉默对放射抗拒鼻咽癌裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响

2．1 材料

2．2 实验方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

参考文献

综述

附录

致谢

攻读学位期间发表论文