PAS-Na对锰致BV2细胞NF-κβ/NLRP3/Caspase-1通路的影响的干预作用

摘要

目的：探讨对氨基水杨酸钠(PAS-Na)对锰致BV2细胞氧化损伤及其对NF-κB/NLRP3/Caspasel通路的影响的干预作用。
　　方法：细胞毒性试验，MTT法检测不同浓度锰、PAS-Na、N-乙酰半胱氨酸(NAC)对BV2细胞存活率的影响，选择合适的染锰浓度（200μmo-1/L）及PAS-Na(100、200、400μmol/L)和NAC（50μmol/L）浓度为干预剂量。BV2细胞随机分为空白对照组（对照组）、PAS-Na对照组、NAC对照组、阳性对照组、染锰组、染锰+PAS-Na(100、200和400μmol/L)干预组、染锰+NAC(50μmol/L)组，正常培养液培养24h。弃原培养液，对照组、PAS-Na对照组、NAC对照组分别加入新培养液培养、含400μmol/L PAS-Na培养液和含50μmol/LNAC培养液，染锰组、染锰+PAS-Na（100、200和400μmol/L）干预组加入含200μmol/L MnCl2的培养液，培养24h。之后弃原培养液，对照组、PAS-Na对照组、NAC对照组和染锰组加入正常培养液培养，染锰+PAS-Na（100、200和400μmol/L）干预组，分别加入含100、200和400μmol/LPAS-Na培养液，其余组加新的培养基，培养12、24、48h。采用活性氧检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、ATP含量测定试剂盒、荧光定量PCR技术(qPCR)分别测定各组细胞ROS生成水平、线粒体膜电位改变、ATP生成水平及P65、NLRP3、caspsase-1、IL-1β、IL-18mRNA的表达情况。
　　结果：50umol/L锰浓度处理可使BV2细胞存活率升高。但随着染锰浓度的升高，BV2细胞存活率下降，差异有统计学差异(P＜0.05)，并具有定的时间/剂量-反应关系。PAS-Na干预48h时可使BV2细胞存活率升高且具有一定的剂量反应关系(P＜0.05)。染锰（200μmol/L）24h后，可使BV2细胞生成ROS生成量升高，PAS-Na可拮抗锰导致的ROS的生成量增高，并随着浓度的增加及随时间延长，ROS的生成量越低(P＜O.05)，但其干预效果比NAC差。染锰24h后，BV2细胞线粒体膜电位及ATP的生成量降低(P＜0.05)，PAS-Na干预12h，对改善线粒体膜电位及ATP生成量效果不明显（P＞0.05），但干预48h时效果显著(P＜0.05)。锰可使BV2细胞NF-κB P65、NLRP3、caspase-1、IL-1β和1L-18mRNA表达水平升高，PAS-Na可逆转锰导致的P65、NLRP3、caspase-1、IL-1β表达升高，但IL-18不降反升(P＜0.05)。
　　结论：(1)过量锰暴露(200μmol/L)可引起BV2细胞氧化损伤，线粒体功能障碍及ATP耗竭。(2)过量锰暴露（200μmol/L）可通过介导NF-κ/NLRP3/Caspase-1炎症通路在BV2细胞引发炎症反应。(3)PAS-Na对锰致BV2细胞氧化损伤及炎症反应具有拮抗作用。

目录

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个人简历

英文缩写

摘要

前言

1．材料

1．2 主要试剂

2．1 细胞培养及传代

2．2 MTT法测定BV2细胞存活率

2．2．1 检测不同染锰浓度BV2细胞的存活率

2．2．2 检测不同PAS-Na处理浓度BV2细胞的存活率

2．2．3 检测不同NAC浓度处理BV2细胞的存活率

2．3 PAS-Na对锰致BV2细胞ROS的生成的影响

2．3．1 荧光显微成像系统检测各组BV2细胞ROS生成水平

2．3．2 流式细胞仪检测各组BV2细胞ROS生成量

2．4 PAS-Na对锰致BV2细胞线粒体膜电位改变得影响

2．4．1 荧光显微成像系统检测各组BV2细胞MMP改变情况

2．4．2 流式细胞仪定量检测组BV2细胞MMP改变情况

2．5 ATP含量检测

2．5．1 样本制备

2．5．2 蛋白浓度检测

2．5．3 检测ATP浓度

2．6．1 引物合成

2．6．2 提取总RNA

2．6．3 总RNA逆转录

2．6．4 qPCR反应

2．7 统计方法

3 结果

3．1 BV2细胞存活率

3．1．1 锰对BV2细胞存活率的影响

3．1．2 PAS-Na及NAC对BV2细胞存活率的影响

3．1．3 PAS-Na对锰致BV2细胞存活率的影响

3．2．1 荧光显微成像系统观察各组BV2细胞ROS生成水平

3．2．2 流式细胞仪检测各组BV2细胞ROS生成量

3．3 PAS-Na对锰致BV2细胞MMP改变的干预作用

3．3．1 荧光显微成像系统观察MMP改变情况

3．3．2 流式细胞仪检测MMP改变情况

3．4 PAS-Na对锰致BV2细胞ATP含量的改变的干预作用

3．5 PAS-Na对锰致BV2细胞P65、NLRP3、caspsase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表达改变的影响

4．讨论

5．结论

参考文献

附录

综述 锰中毒的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表学术论文