锰通过BNIP3介导的氧化应激诱导多巴胺能神经元线粒体自噬

摘要

目的：探讨线粒体自噬受体蛋白BNIP3是否通过调节ROS生成介导MnCl2诱导具有多巴胺能作用的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞发生线粒体自噬。 方法：(1).细胞毒性检测:取对数生长期的入神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，使用细胞增殖/毒性检测试剂盒CCK-8检测不同时间及不同浓度MnCl2作用下SH-SY5Y细胞的细胞活力;使用流式细胞仪检测MnCl2作用下SH-SY5Y细胞线粒体膜电位改变情况。(2).MnCl2诱导SH-SY5Y细胞线粒体自噬检测:经MnCl2处理24h后采用蛋白免疫印记法检测线粒体自噬受体蛋白BNIP3、线粒体外膜标记蛋白TOMM20的表达量及自噬标记蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化情况;应用透射电子显微镜直接观察MnCl2作用下SH-SY5Y细胞的线粒体形态改变情况及线粒体自噬是否发生;应用自噬抑制剂3-MA反证MnCl2作用下SH-SY5Y细胞内线粒体自噬体是否形成;使用荧光共聚焦显微镜检测MnCl2作用下线粒体是否通过溶酶体途径降解。(3).ROS的生成量及ROS参与MnCl2诱导SH-SY5Y细胞线粒体自噬检测:使用酶标仪检测MnCl2作用下SH-SY5Y细胞内ROS的生成量，并使用抗氧化剂NAC反证MnCl2是否可导致ROS生成增多;应用蛋白免疫印记法检测经抗氧化剂NAC预处理后线粒体自噬受体蛋白BNIP3、线粒体外膜标记蛋白TOMM20的表达量及自噬标记蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化情况;应用透射电镜及加用自噬抑制剂3-MA进一步检测ROS是否参与MnCl2诱导SH-SY5Y细胞发生线粒体自噬。(4).BNIP3通过调节ROS生成介导MnCl2诱导SH-SY5Y细胞发生线粒体自噬及神经毒性检测:运用免疫共沉淀法验证SH-SY5Y细胞中线粒体自噬受体蛋白BNIP3与自噬标记蛋白LC3蛋白是否能相互结合;使用BNIP3shRNA干扰SH-SY5Y细胞中BNIP3的表达，观察BNIP3低表达对MnCl2诱导SH-SY5Y细胞线粒体形态改变及线粒体自噬、ROS生成、自噬标记蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转换及线粒体外膜标记蛋白TOMM20表达量的影响。 结果：(1).MnCl2可使SH-SY5Y细胞活力呈时间及浓度依赖性下降，并使线粒体膜电位呈浓度依赖性降低。(2).MnCl2可使粒体自噬受体蛋白BNIP3的表达量及自噬标记蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化呈浓度依赖性升高并使线粒体外膜标记蛋白TOMM20的表达呈浓度依赖性降低;400μmol/LMnCl2作用24小时后可使SH-SY5Y细胞内线粒体膨胀、溶解或凝聚、变性并使线粒体自噬小体形成增多，且MnCl2作用下可使线粒体标记物MitoTracker(@)及溶酶体标记物LysoTracker(@)荧光共定位情况增多;自噬抑制剂3-MA与400μmol/L MnCl2共培养可减少SH-SY5Y细胞内线粒体自噬小体的形成并减少线粒体标记物MitoTracker(@)与溶酶体标记物LysoTracker(@)荧光共定位情况，其还可降低线粒体自噬受体蛋白BNIP3的表达量及减少自噬标记蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化并使线粒体外膜标记蛋白TOMM20的表达升高。(3).SH-SY5Y细胞内ROS生成随MnCl2浓度的加大而增多，使用抗氧化剂NAC可减轻400μmol/L MnCl2作用下ROS的产生，同时NAC还可降低线粒体自噬受体蛋白BNIP3的表达量及减少自噬标记蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化并使线粒体外膜标记蛋白TOMM20的表达增多及减少线粒体自噬小体形成，而自噬抑制剂3-MA并不能抑制ROS生成。(4).SH-SYSY细胞中的线粒体自噬受体蛋白BNIP3和自噬标记蛋白LC3可有效地相互结合;干扰BNIP3表达可减少自噬标记蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化并使线粒体外膜标记蛋白TOMM20的表达增多，同时BNIP3表达减少还可使400μmol/L MnCl2作用24小时后的SH-SY5Y细胞内的线粒体自噬体形成减少，且在400μmol/L MnCl2作用下，BNIP3低表达细胞株的ROS生成及线粒体膜电位丢失减少。 结论：线粒体自噬受体蛋白BNIP3通过调节ROS的生成介导MnCl2诱导多巴胺能神经元线粒体自噬。BNIP3的这种功能可能是锰致神经毒性的作用机制之一。