抗鼻咽癌中药单体筛选及黄芩素抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭迁移的作用机制研究

摘要

目的: 本研究通过对17种中药单体进行筛选，寻找具有抑制鼻咽癌细胞增殖能力的中药单体并探索其作用机制。研究内容主要包括三部分:1.筛选具有抑制鼻咽癌细胞增殖能力的中药单体;2.研究黄芩素对鼻咽癌细胞增殖和侵袭迁移的影响;3.研究黄芩素抑制鼻咽因癌细胞增殖和侵袭迁移的作用机制。 方法: 1、以低分化鼻咽癌细胞株CNE2作为模型，使用CCK-8筛选具有抑制CNE2增殖能力的中药单体。 2、利用CCK-8与克隆形成实验考察黄芩素对鼻咽癌细胞增殖的影响;利用流式细胞术检测黄芩素对细胞凋亡和细胞周期的影响;利用细胞荧光染色技术观察黄芩素对细胞染色质的影响;检测Caspase-3活性，评价黄芩素对Caspase-3蛋白活性的影响;利用划痕实验、异质性黏附实验及Transwell侵袭与迁移实验考察黄芩素对侵袭迁移的影响。 3、通过网络药理学预测黄芩素的作用靶点;使用Western blot检测黄芩素对MAPK和p53信号通路关键蛋白表达情况的影响;利用qRT-PCR检测黄芩素对细胞周期相关基因及MPs基因mRNA的影响。 结果: 1、使用CCK-8法从17种黄酮类中药单体中，筛选出6种具有抑制低分化鼻咽癌细胞增殖能力的中药单体，这6种中药单体分别是:二氢杨梅素、木犀草素、黄芩素、穗花杉双黄酮、高良姜素及茶黄素。 2、CCK-8实验发现黄芩素能显著抑制鼻咽癌细胞增殖，且成剂量和时间依赖性;克隆形成实验发现黄芩素可抑制鼻咽癌细胞增殖并能减弱其干细胞性;黄芩素作用鼻咽癌细胞后，流式细胞术发现细胞凋亡显著增加，同时发现细胞周期被阻滞于S期，使用荧光显微镜也观察到典型的细胞凋亡特征，且通过检测Caspase-3活性发现黄芩素可显著提高Caspase-3活性;Transwell侵袭实验与异质性黏附实验发现黄芩素可显著抑制鼻咽癌细胞侵袭及黏附能力;划痕实验及Transwell迁移实验发现黄芩素能显著抑制鼻咽癌细胞迁移能力。 3、利用网络药理学预测得到79个黄芩素的靶点蛋白，富集分析结果显示黄芩素可对MAPK信号通路进行调控;使用Western blot检测MAPK及p53信号通路关键蛋白，发现JNK和MAPKAPK2磷酸化显著增加，p53、Bax、Caspase-3蛋白表达量显著上调;使用qRT-PCR检测周期相关基因，发现p53、p21mRNA显著上调，CDK2mRNA显著下调;使用qRT-PCR检测MPs基因，发现MMP1、MMP2、MMP7及MMP9mRNA显著下调。 结论: 1、通过对17种黄酮类中药单体筛选，发现二氢杨梅素、木犀草素、黄芩素、穗花杉双黄酮、高良姜素及茶黄素具有抑制低分化鼻咽癌细胞株CNE2增殖能力。 2、黄芩素可通过调控MAPK及p53信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡，此外，黄芩素还可通过下调MMP1、MMP2、MMP7及MMP9mRNA的表达抑制鼻咽癌细胞侵袭迁移。