3--羟基丁酸脱氢酶2通过干扰铁稳态影响鼻咽癌细胞增殖及侵袭的研究

摘要

鼻咽癌是来源于鼻咽上皮的恶性肿瘤，好发于鼻咽腔顶部、侧壁及咽隐窝，是我国南方的高发恶性肿瘤之一。鼻咽癌的流行病学呈明显的地域分布特征，在我国的华南地区，其发病率高达15-30/100，000（人/年）。鼻咽癌病因复杂，目前认为与EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)感染、环境因素、种族易感性及遗传因素密切相关。由于鼻咽部解剖结构复杂、部位特殊，肿瘤细胞对放射线中度敏感，所以放射治疗一直是鼻咽癌的首选治疗方式。近年来，随着诊断水平、放射治疗技术和多学科综合治疗的发展，鼻咽癌的疗效已获得大幅提高。目前鼻咽癌治疗的失败原因不仅是治疗后局部复发，还有治疗前或治疗后的远处转移。因此，研究鼻咽癌相关的分子机制，寻找新的治疗靶点是鼻咽癌治疗的未来方向。 铁参与多种体内生命代谢过程，包括DNA合成、氧运输、三羧酸循环等，促进细胞的增殖、侵袭。肿瘤细胞被证实可以通过调节相关蛋白的表达，增加铁摄入，降低细胞内贮存铁的含量，使更多的铁参与肿瘤细胞的代谢，维持肿瘤细胞的生长。3-羟基丁酸脱氢酶2(BDH2)基因位于人类染色体4q24，参与人体酮体代谢，同时还通过催化哺乳动物铁载体结合不稳定铁，调控细胞内的铁稳态。研究发现铁代谢是肿瘤治疗的靶点，而铁螯合剂药物在肿瘤治疗日益广泛的运用。目前，BDH2和铁代谢与鼻咽癌的研究甚少，因此，本研究中我们探索了BDH2在鼻咽癌中的表达情况，探究其对鼻咽癌恶性生物学行为的影响，从铁代谢角度研究深入了解了鼻咽癌的相关分子机制。 目的： 探索BDH2基因在鼻咽癌中的表达及其对鼻咽癌恶性生物学行为的影响;探究BDH2基因调控铁代谢影响鼻咽癌增殖和侵袭的可能分子机制。 方法： 1.通过荧光定量聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)法及免疫组织化学染色法(Immunohistochemistry)验证BDH2基因在鼻咽癌中的转录和蛋白的表达情况。 2.用脂质体转染法构建外源性稳定过表达BDH2基因的鼻咽癌细胞系，通过MTT比色法检测增殖曲线、克隆形成实验、裸鼠成瘤实验验证BDH2对鼻咽癌细胞增殖的影响。 3.利用基因芯片（Microarray）技术检测外源性稳定过表达BDH2基因的鼻咽癌细胞基因表达谱情况，并运用GCBI(Gene Cloud of Biotechnology Information)数据平台分析测序数据结果。 4.通过细胞划痕实验以及细胞侵袭实验验证BDH2基因对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响，同时利用Western blot方法验证基因芯片分析结果，确定侵袭相关因子E-Cadherin，Vimintin，β-Catenin，SPARC，EPCAM的表达，评价BDH2基因对鼻咽癌迁移和侵袭的影响，阐明其分子机制。 5.通过铁离子检测试剂盒检测过表达BDH2鼻咽癌细胞内铁离子含量。 6.利用不同浓度外源性铁离子(Fe2+)及游离铁螯合剂(Deferoxamine，DFX)处理鼻咽癌细胞系，通过MTT增殖实验、2D细胞划痕实验及3D细胞侵袭实验，检测铁离子对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响。 结果： 1.BDH2基因在鼻咽癌细胞和组织中低表达 首先通过实时荧光定量PCR方法检测BDH2基因在鼻咽癌细胞(HONE1、HK1、CNE1、CNE2、TW03、5-8F)的转录水平，与正常鼻咽上皮细胞系(NP460、NP69)相比，BDH2基因在鼻咽癌细胞系中转录水平下调;进一步使用实时荧光定量PCR和免疫组织化学技术验证鼻咽癌组织中BDH2的转录和表达情况，结果显示BDH2在鼻咽癌组织中的转录和表达水平明显低于正常鼻咽组织（P＜0.05）。 2.外源性表达BDH2基因抑制鼻咽癌细胞增殖 构建过表达BDH2基因鼻咽癌稳转细胞系，并通过Real time RT-PCR及Western blot对稳转细胞系进行验证。后通过MTT细胞增殖实验、克隆形成及裸鼠成瘤实验评估BDH2基因对鼻咽癌细胞的影响，结果发现转染BDH2的鼻咽癌细胞生长速度较对照组细胞降低，提示外源性表达BDH2基因可以抑制鼻咽癌细胞的增殖。 3.BDH2基因改变鼻咽癌细胞侵袭相关基因表达，抑制鼻咽癌细胞侵袭 通过基因芯片技术检测过表达BDH2稳定转染鼻咽癌细胞系，发现与对照组细胞系相比，转染BDH2细胞中与侵袭相关基因E-Cadherin，EPCAM表达上调，Vimintin，β-Catenin，SPARC发生下调。通过细胞划痕和Transwell体外侵袭实验验证BDH2基因对鼻咽癌细胞的影响，结果显示，BDH2可以抑制鼻咽癌侵袭能力。通过实时荧光定量PCR和Western blot检测鼻咽癌细胞系中E-Cadherin，EPCAM，β-Catenin，SPARC的表达，结果发现，与对照组相比，β-Catenin、Vimentin、SPARC表达下降，E-cadherin表达升高。提示过表达BDH2基因通过改变上皮间质-转化(EMT)相关基因抑制鼻咽癌细胞的侵袭能力。 4.BDH2通过减少铁离子含量抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移与侵袭 通过铁离子检测试剂盒发现过表达BDH2的鼻咽癌细胞中铁离子含量降低，MTT细胞增殖实验发现鼻咽癌细胞增殖速度随着铁螯合剂浓度升高而降低，成反比关系;补充铁离子可以恢复经铁螯合剂处理后鼻咽癌细胞的增殖能力。通过细胞划痕实验及Transwell细胞侵袭实验发现铁促进鼻咽癌细胞迁移与侵袭。提示BDH2可以通过减少铁离子含量抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移与侵袭能力。 结论： 1.BDH2在鼻咽癌细胞和组织中转录和表达下调; 2.过表达BDH2基因可抑制鼻咽癌细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力; 3.BDH2基因通过调节细胞内铁离子水平进而抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移。 综上提示，BDH2基因可能是鼻咽癌的一个候选的抑癌基因。