PAMAM-PO3H2协同PAMAM-COOH模拟DMP-1诱导Ⅰ型胶原纤维矿化的能力及机制探索

摘要

研究目的:基于对牙本质基质蛋白1（Dentin matrix protein-1，DMP-1）在牙本质生物矿化过程中的重要调控作用以及非经典矿化相关理论的认识，本研究分别以磷酸改性的聚酰胺-胺树枝状大分子（PAMAM-PO3H2）和羧基改性的聚酰胺-胺树枝状大分子(PAMAM-COOH)模拟DMP-1在牙本质矿化过程中对无定形磷酸钙的双重调控作用，评估二者协同诱导Ⅰ型胶原纤维内外磷灰石晶体成核生长的能力，探索其诱导矿化的机制，为牙本质的仿生矿化研究提供新的策略。
　　研究方法:制作涂覆薄层Ⅰ型胶原的碳膜镍网28个，交联剂稳定重组胶原后，2.5％wt PAMAM-PO3H2和三聚磷酸钠(Sodium tripolyphosphate，STPP)各浸泡处理8个含重组Ⅰ型胶原的镍网5min，各随机选取4个相应地浸泡于含PAMAM-COOH或聚丙烯酸(Poly acrylic acid，PAA)(1mg/ml)的模拟体液(Simulated body fluid，SBF)/复合树脂硅酸盐水门汀矿化体系（即PAMAM-PO3H2+PAMAM-COOH组、STPP+PAA对照组，n=4）中;另4个则浸泡在SBF/复合树脂硅酸盐水门汀矿化体系（即PAMAM-PO3H2组、STPP对照组，n=4）。另外12个未处理的胶原镍网随机分成3组，分别浸泡于含PAMAM-COOH（或PAA）的SBF/复合树脂硅酸盐水门汀矿化体系（即PAMAM-COOH组、PAA对照组，n=4）或SBF/复合树脂硅酸盐水门汀矿化体系中（空白对照组，n=4）。37℃恒温箱内矿化12、24、48、72h后，采用透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM;80kv)观察矿物在胶原内外形成的情况及其形貌;同时采用选区电子衍射(Selected area electron diffraction，SAED;200kv)分析矿物结晶相。
　　研究结果:空白对照组:胶原矿化过程中，碳膜镍网上出现不同形态及尺寸的无定形磷酸钙（Amorphous calcium phosphate，ACP）颗粒，72h后转化为磷灰石结晶，胶原无矿化。
　　模板类似物组:STPP对照组矿化12h后在胶原表面形成不同尺寸形状不一的纳米ACP相;矿化24-48h后，圆钝的ACP纳米相转化成棱角分明的磷灰石;72h后，在胶原表面形成不规则沉积的块状晶体，未见纤维内矿化特征。PAMAM-PO3H2组矿化12h后，可见ACP纳米颗粒附着在胶原表面;24-48h后，纤维表面ACP纳米颗粒增大为圆钝ACP相继而转化为棱角明显的磷灰石矿物沉积;72h后，在胶原表面的矿物沉积转化成不规则但有一定取向的块状沉积，与STPP对照组相比，所形成的矿物沉积与纤维的关系欠紧密。
　　ACP稳定类似物组:PAA对照组矿化12-24h后，未见成形纳米ACP颗粒，但矿化24h后，胶原膨胀直径增大，电子密度降低横纹消失且胶原表面形成云雾状纳米ACP;48h后，膨胀的胶原表面形成ACP纳米颗粒;72h后，胶原纤维膨胀样改变消失，胶原呈矿物沉积后电子密度增高改变，分布较均匀且连续，但未见矿物有序沉积横纹样结构。PAMAM-COOH组矿化12h后形成大量纳米ACP颗粒形成，矿化24h后，胶原纤维局部形成不规则ACP相;48h后，ACP纳米液相分布于纤维表面;72h后，胶原局部电子密度增高呈条索状，未见胶原内矿物有序沉积横纹样结构。
　　协同诱导组:STPP+PAA对照组在无定形阶段(12-24h)，膨胀的胶原纤维内横纹样特征消失，胶原表面形成云雾样无定形ACP;在结晶阶段(48-72h)，在部分矿化的胶原中逐渐出现横纹特征，纳米磷灰石沉积形成横纹，沿纤维长轴长约44nm。PAMAM-PO3H2+PAMAM-COOH组无定形阶段(12-24h)，膨胀的胶原纤维横纹样特征模糊可见，胶原表面形成云雾样无定形ACP同时出现ACP纳米颗粒;在结晶阶段，矿化48h后胶原纤维脱水矿化，电子密度不均匀增高，表面局部膨大圆钝;72h后，胶原表面形成不规则排列的纳米磷灰石矿化沉积，未见矿物有序沉积形成的横纹特征。
　　研究结论:1.PAMAM-COOH具有稳定ACP的作用，PAMAM-PO3H2可诱导ACP在胶原纤维表面相变成核结晶矿化形成疏松的多晶矿物沉积。
　　2.在PAMAM-COOH稳定ACP为瞬时纳米前体的情况下，采用PAMAM-PO3H2作为结晶成核模板，具有通过非经典矿化结晶途径，体外诱导Ⅰ型胶原纤维内、外矿物沉积，实现矿化重组Ⅰ型胶原的能力，可作为一种潜在的仿生再矿化脱矿牙本质胶原纤维的研究策略。

目录

声明

个人简历

英文缩略词表

摘要

前言

1．1 材料

1．1．1 I型胶原自组装体系

1．1．2 牙本质基质蛋白仿生类似物

1．1．3 模拟体液

1．1．4 亲水性树脂各组分及重量比

1．1．5 白色硅酸盐水门汀

1．1．6 仪器设备

1．2 方法

1．2．2 释放氢氧根离子的复合树脂的制备

1．2．3 模拟体液的配制

1．2．4 Ⅰ型胶原纤维的自组装

1．2．5 胶原的磷酸化

1．2．6 胶原分组及矿化处理

2 结果

2．1 PAMAM-PO3H2的表征

2．2 复合树脂块氢氧根离子的释放

2．3 空白组的矿物沉积

2．4 模板类似物组的矿物沉积

2．5 ACP稳定类似物组的矿物沉积

2．6 协同诱导的矿物沉积

3 讨论

4 结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文