裂果薯甾体皂苷的特征图谱与有效组分的体外抗肿瘤活性研究及筛选

摘要

目的:1.比较高效液相色谱紫外及蒸发光散射检测器两种检测方法检测裂果薯皂苷成分，建立裂果薯总皂苷的特征图谱，寻找总皂苷中抗肿瘤的主要活性成分，并考察裂果薯皂苷乙醇水溶液的稳定性。2.采用高效液相色谱紫外及蒸发光散射检测器建立裂果薯皂苷SFSP60％高效液相色谱ELSD的特征图谱，探讨皂苷中各有效组分的相互作用及对体外抗肝癌活性的影响。3.使用裂果薯总皂苷、皂苷化合物SPHSⅠ和SPHSⅡ筛选能被抑制增殖的肿瘤细胞，以及它们对人非小细胞肺癌H460和A549凋亡诱导的初步研究。 方法:1.采用80％乙醇在常压下提取裂果薯块茎，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取醇提物，将正丁醇组段经D101大孔吸附树脂富集皂苷，按50％～95％乙醇梯度洗脱收集各组分皂苷;将60％乙醇组分用硅胶柱和Sephadex LH-20凝胶柱进行分离纯化，得到裂果薯皂苷化合物。2.采用高效液相色谱紫外和ELSD联用法，建立裂果薯中甾体皂苷的高效液相色谱ELSD特征图谱，并且观察裂果薯皂苷乙醇水溶液在4℃冰箱中保存半年的稳定性。同时采用MTT法观察裂果薯皂苷SFSP60％对人肝癌BEL-7404细胞增殖的影响及SFSP60％、SPHSⅠ和SPHSⅡ对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用。3.采用MTT法观察SFSP总、SPHSⅠ和SPHSⅡ对非小细胞肺癌H460和A549、人卵巢癌细胞SKOV3、人鼻咽癌细胞CNE-1的增殖抑制作用。用AO-EB染色法观察SFSP总、SPHSⅠ和SPHSⅡ对人非小细胞肺癌H460和A549凋亡形态的影响。 结果:1.22.3kg裂果薯根茎经过提取、萃取、D101大孔吸附树脂洗脱后得到42.79g裂果薯总皂苷（含量为98.56％）;60％乙醇组分经过硅胶柱和Sephadex LH-20凝胶柱反复分离纯化，得到11915.7mg裂果薯皂苷Ⅰ和1180.7mg裂果薯皂苷Ⅱ。在裂果薯总皂苷蒸发光散射检测器色谱图中可见0～30min间出现了10个明显的特征峰，其中两个化合物为SPHSⅠ和SPHSⅡ，化合物1-8可能是与SPHSⅠ和SPHSⅡ母核类似的皂苷类化合物。根据面积归一法，计算得出SPHSⅠ和SPHSⅡ在SFSPTotal中相对百分比为42.52％和1.61％，化合物1为0.64％，化合物2为1.06％，化合物3为4.46％，化合物4为14.61％，化合物5为3.73％，化合物6为2.00％，化合物7为6.49％，化合物8为21.44％。且在色谱图中，SPHSⅠ和SPHSⅡ的相对比值为26.355∶1;裂果薯皂苷SFSP60％蒸发光散射检测器色谱图在0～30min出现了5个明显的特征峰，表明在SFSP60％中至少存在5种化合物，其中两个为SPHSⅠ和SPHSⅡ，化合物1-3可能也是与SPHSⅠ和SPHSⅡ母核类似的皂苷类化合物。根据面积归一法，计算出SPHSⅠ和SPHSⅡ在SFSP60％中相对百分比为84.28％和3.02％，化合物1为2.21％，化合物2为6.31％，化合物3为2.73％，SPHSⅠ和SPHSⅡ的相对比值为27.937∶1。SFSP60％乙醇水溶液在4℃冰箱储存条件下至少能保存2个月，但在2～6个月内溶液内部有可能发生降解、糖链脱落等反应而影响溶液的稳定性;单体SPHSⅠ和SPHSⅡ乙醇水溶液，在4℃冰箱条件下储存，能够至少保持6个月的时间且溶液内部无明显降解或改变。 2.采用MTT法观察并计算人肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制率和IC50。SFSP60％（含量:98.55％）在24、48、72h时的IC50值分别为3.75、1.56、0.95μg/mL,SPHSⅠ（纯度:96.91％）在24、48、72h时的IC50值分别为2.048、1.193、0.632μg/mL,SPHSⅡ（纯度:98.07％）在24、48、72h时的IC50值分别为1.941、1.054、0.499μg/mL,SPHSⅠ+Ⅱ在24、48、72h时的IC50值分别为1.728、0.799、0.470μg/mL。结果显示给药组对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用呈现时间与剂量依赖性(均P＜0.05)，且活性大小:SFSP60％＜SPHSⅠ、SPHSⅡ＜SPHSⅠ+Ⅱ[1]。 3.SFSPTotal、SPHSⅠ和SPHSⅡ显著抑制人非小细胞肺癌H460和A549、人卵巢癌细胞SKOV3、人鼻咽癌细胞CNE-1的增殖，且作用呈现时间与剂量依赖性（均P＜0.05）。SFSPTotal对A549和SKOV3细胞抗肿瘤效果相对较好;SPHSⅠ对H460和SKOV3细胞抗肿瘤效果相对较好;SPHSⅡ对H460细胞抗肿瘤效果相对较好。AO-EB染色结果显示，空白对照组细胞核形态清晰完整，呈绿色荧光;给药组细胞形态有明显的改变，如早期凋亡细胞核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状，晚期凋亡细胞核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。 结论:1.初步建立裂果薯总皂苷和裂果薯皂苷SFSP60％的高效液相色谱ELSD特征图谱的方法，且高效液相蒸发光散射检测法优于紫外检测法;SFSP60％和SFSP70％为裂果薯总皂苷中抗肿瘤的主要活性成分，且SFSP60％、SPHSⅠ、SPHSⅡ的乙醇水溶液均能在4℃冰箱条件下保存2个月没有明显改变，SPHSⅠ和SPHSⅡ能保存至6个月。2.在SFSPTotal和SFSP60％中是SPHSⅠ和SPHSⅡ发挥主要抗肿瘤作用，且抗肿瘤作用是各组分共同作用的结果。此外，多种组分共同作用的结果可能是降低药物总体的抗肿瘤活性。3.SFSPTotal、SPHSⅠ和SPHSⅡ对人非小细胞肺癌H460和A549、人卵巢癌细胞Skov-3、人鼻咽癌细胞CNE-1均具有增殖抑制作用，有广谱抗肿瘤作用，且对H460和A549细胞有诱导凋亡的作用。