神经营养因子NT3及其受体TrkC在锰致神经毒性中的作用及其机制

摘要

目的： 通过体外培养的小鼠原代神经元及体内小鼠短期、慢性染锰实验，测定不同浓度锰处理组神经营养因子NT3与其受体TrkC及其激活的下游信号转导通路相关蛋白和凋亡蛋白的表达情况，探讨NT3及其受体TrkC在锰致神经毒性的潜在作用机制。 方法： 将体外培养的小鼠神经元经不同浓度的MnCl2·4H2O溶液处理24小时后，在倒置相差显微镜下观察染锰后细胞形态改变，经MTT法测定其存活率，确定小鼠神经元实验各处理组的染锰浓度。小鼠神经元按不同浓度染锰24小时后，经荧光定量PCR分析TrkC及NT3的mRNA表达水平;经Western Blot测定不同染锰剂量及不同染锰时间的细胞中NT3与TrkC及其下游信号转导通路相关蛋白(p-Akt、Akt，p-Erk，Erk，P-CREB，CREB)表达水平和其下游凋亡相关蛋白(Caspase3、Bax和Bcl2)的含量变化;经免疫荧光观察小鼠神经元内NT3及TrkC定位及变化情况;经TMRM染料染色后，分别经荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞的线粒体膜电位的变化情况;采用Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒、Tunel凋亡试剂盒及DAPI染色检测其凋亡率。为验证在锰作用下，TrkC受体是否会在NT3缺乏情况下被Caspase3切割，将小鼠神经元分别预先经NT3及Caspase的拮抗剂Z-VAD-FAM处理后按200μM剂量染锰24小时，观察细胞形态变化并再次检测以上指标变化情况。此外，将24只雄性C57BL/6小鼠随机分为0、5、20、50mg/kg剂量组，分别经腹腔注射生理盐水及相应浓度的MnCl2·4H2O溶液，每周5天，连续2周;同时将36只雄性C57BL/6小鼠，随机分为对照组、100mg/L组、200mg/L组和400mg/L组。暴露组按对应剂量，通过饮用水暴露锰，对照组予以普通饮用水，持续暴露32周。染锰结束后提取小鼠皮层及海马蛋白，经Western Blot检测NT3与TrkC及其下游信号转导通路相关蛋白表达水平和其下游凋亡相关蛋白的含量变化。 结果： 1.与0μM剂量组相比，当染锰浓度等于或高于200μM时，随着染锰浓度的升高，原代小鼠神经元的存活率下降(p＜0.05)。不同浓度的锰可以引起小鼠神经元不同程度的损伤并出现形态学改变。 2.与0μM剂量组相比，随着染锰浓度的增高，小鼠神经元中核分裂及核固缩相数目增多，被脱氧核糖核苷酸末端转移酶标记DNA断裂的细胞数目增多。与0μM剂量组相比，400μM剂量组的AnnexinⅤ+/PI-和AnnexinⅤ+/PI+细胞数目约提高15％;200μM及400μM剂量组的AnnexinⅤ-/PI+细胞数目约提高16％(p＜0.05)。 3.与0μM剂量组相比，随着染锰浓度的增高，小鼠神经元内NT3及TrkC的mRNA水平下降，蛋白表达水平降低(p＜0.05)，细胞膜上NT3及TrkC荧光强度减弱。 4.与0μM剂量组相比，随着染锰浓度的增高，小鼠神经元内NT3与TrkC及其激活的下游信号转导通路相关蛋白及其下游的凋亡蛋白表达水平改变。其中:pAkt、pErk1/2、pCREB、Bcl2蛋白含量随着染锰浓度的升高而降低(p＜0.05);与之相反，促调亡蛋白Bax和Cleav-Caspase3含量随着锰处理浓度的升高而增加(p＜0.05)。 5.与0μM剂量组相比，随着染锰浓度升高，小鼠神经元经TMRM标记的荧光强度降低;200μM及400μM线粒体膜电位水平分别下降了20％及40％(p＜0.05)。 6.与0小时相比，小鼠神经元经200μM锰处理组后12小时左右可观察到细胞损伤及形态改变。小鼠神经元内NT3与TrkC及其激活的下游信号转导通路相关蛋白及其下游的凋亡蛋白表达水平随着时间的变化而改变，但各蛋白开始改变的时间有差异。其中:pAkt、pErk1/2、pCREB、Bcl2蛋白含量随着染锰时间的增加而降低(p＜0.05);与之相反，促凋亡蛋白Bax和Cleav-Caspase3含量随着锰处理时间的增加而降低(p＜0.05)。 7.小鼠神经元预先经NT3及Z-VAD-FAM处理两个小时后，TrkC及其激活的下游信号转导通路相关蛋白及其下游的凋亡蛋白表达水平改变。其中，与直接200μM锰处理组相比pAkt、pErk1/2、pCREB、Bcl2蛋白含量升高(p＜0.05);与之相反，促凋亡蛋白Bax和Cleav-Caspase3含量下降(p＜0.05)。 8.小鼠神经元预先经NT3及Z-VAD-FAM处理两个小时后，与直接经200μM锰处理组相比，其经TMRM标记后的荧光强度升高，线粒体膜电位水平都增高15％左右(p＜0.05)。 9.小鼠神经元预先经NT3及Z-VAD-FAM处理两个小时后，与直接200μM锰处理组相比，神经元中核分裂及核固缩相数目减少，被脱氧核糖核苷酸末端转移酶标记的DNA断裂数目降低，Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+细胞数目约分别降低10％及12％(p＜0.05)。 10.小鼠经短期腹腔注射染锰后，皮层及海马中NT3与TrkC及其激活的下游信号转导通路相关蛋白及其下游的凋亡蛋白表达水平发生改变。其中:pAkt、pErk1/2、pCREB、Bcl2蛋白含量随着染锰浓度的升高降低(p＜0.05);与之相反，促凋亡蛋白Bax和Cleav-Caspase3含量随着锰处理浓度的升高而增加(p＜0.05)。 11.小鼠经饮水慢性染毒后，皮层中NT3与TrkC及其激活的下游信号转导通路相关蛋白及其下游的凋亡蛋白表达水平发生改变。其中:pAkt、pErk1/2、pCREB、Bcl2蛋白含量随着染锰浓度的升高降低(p＜0.05);与之相反，促凋亡蛋白Bax含量随着锰处理浓度的升高而增加(p＜0.05)。 结论： 1.染锰可导致体外培养的小鼠原代神经元形态改变，引起细胞不同程度的损伤，并降低细胞的存活率。染锰也可以导致体外培养的小鼠神经元线粒体膜电位改变并引起细胞凋亡。 2.锰可以影响NT3与TrkC及其激活的下游信号转导通路相关蛋白，并改变其下游凋亡蛋白的表达水平。 3.NT3及Z-VAD-FAM通过改善锰致NT3与TrkC及其激活的下游信号转导通路相关蛋白以及凋亡蛋白的改变水平，从而减轻锰所致的神经毒性作用。