异基因造血干细胞移植后患者外周血差异表达miRNA与口腔cGVHD关系的研究

摘要

口腔慢性移植物抗宿主病(Oral chronic graft versus host disease，cGVHD)是一种异基因造血干细胞移植(allogenetic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)后的常见并发症，是影响患者移植后长期生存质量的因素之一。但目前口腔cGVHD病因尚不明确。非编码微小RNA(microRNA，miRNA)可通过调节相关靶基因的表达，从而调控各种免疫细胞的产生、增殖、发育以及免疫应答。目前miRNA已被发现可作为多种疾病发生发展及预后的生物学标志。 目的:通过分析口腔cGVHD与无口腔cGVHD患者外周循环血miRNA的表达差异，通过生物信息学分析与验证，初步分析miRNA在口腔cGVHD发生发展中可能的调控作用。 方法:1.回顾分析94例HLA全相合的异基因干细胞移植患者病史资料，探讨口腔cGVHD的临床特点及其发生与患者性别、预处理方案ATG使用情况等患者性别、女供男移植、移植物来源、回输单个核细胞数等临床指标的相关性。 2.口腔cGVHD、无口腔cGVHD、健康对照各8例取外周静脉血，构建miRNAs文库，采用Illumina Hiseq2500平台进行测序，分析miRNAs差异表达，通过Go term和KEGG等生物信息学技术分析探索与口腔cGVHD发生有关的信号通路。 3.采用定量实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR)检测15例口腔cGVHD、15例无口腔cGVHD、15例健康对照外周静脉血miRNA-505-5p、miRNA-769-5p表达情况，通过Go term和KEGG等生物信息学分析其靶基因及作用信号通路。 4.采用qRT-PCR检测口腔cGVHD和无口腔cGVHD各15例外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中Smad2(Drosophila mothers against decapentaplegic protein2)表达水平，采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组血浆中Smad2蛋白含量。 结果:1.在94例HLA全相合的异基因干细胞移植患者中，46.8％出现口腔cGVHD。移植后300天内未发生口腔cGVHD的患者在其后发生口腔cGVHD的可能性较低。口腔cGVHD表征多样，除了特征性的网状白色条纹样病损，口干、溃疡/糜烂是最常见的口腔表征，出现比例分别为63.63％与50％。这些病损可单独伴随网状白色条纹样病出现或多种同时出现。口腔cGVHD组患者口腔表征评分为3.81±2.06，VAS评分为3.31±2.13，两者呈正相关。未发现患者性别、预处理方案ATG使用情况、女供男移植、移植物来源、回输单个核细胞数等临床指标与口腔cGVHD的发生存在相关性。 2.口腔cGVHD与无口腔cGVHD组比较发现，在两组中均有表达miRNA为549个，具有显著性差异为72个，包括上调表达32个，下调表达40个;口腔cGVHD组与健康对照组比较发现，在两组中均有表达miRNA为547个，具有显著性差异为327个，包括上调表达164个，下调表达163;无口腔cGVHD组与健康对照组比较发现，在两组中均有表达miRNA为546个，具有显著性差异为245个，包括上调表达160个，下调表达85个;三组比较发现三组中均有表达miRNA为518个，显著差异191个。miRNAs靶基因主要集中在生化过程中的转录环节、细胞组分中的膜蛋白及分子功能中的蛋白结合。差异基因主要集中在癌相关通路、调节磷脂酰肌醇3—激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol3-Protein kinase B，PI3K-Akt)等信号通路。 3.非口腔cGVHD患者外周血循环miRNA-769-5p、miRNA-505-5p表达最高，口腔cGVHD患者次之，健康对照最低。通过ROC分析miRNA-769-5p、miRNA-505-5p在口腔cGVHD诊断上具有一定价值，通过生物信息学方法分析得知口腔cGVHD发生可能与PI3K-Akt信号通路，TGF-β/Smad信号通路相关。 4.口腔cGVHD组患者血浆中Smad2蛋白及PBMC中Smad2mRNA表达较无口腔cGVHD组增高。外周血Smad2mRNA表达与miRNA-769-5p呈负相关。 结论:1、口腔cGVHD是allo-HSCT后的常见并发症，常发生于移植后300天内。口腔cGVHD表征多样，除了特征性的网状白色条纹样病损，口干、溃疡/糜烂是最常见的口腔cGVHD表征。尚未发现患者性别、预处理方案ATG使用情况等患者性别、女供男移植、移植物来源、回输单个核细胞数等临床指标与口腔cGVHD的发生存在相关性。 2、口腔cGVHD、非口腔cGVHD、健康对照之间外周血循环miRNA存在差异性表达。miRNA可能通过影响PI3K-Akt、TGF-β/Smad等信号通路参与口腔cGVHD的发生，miRNA-769-5p、miRNA-505-5p在口腔cGVHD诊断上具有一定价值。 3、外周循环血内的高表达的Smad2可能与口腔cGVHD发生有关。