H6N1亚型禽流感病毒在猪和人呼吸道组织复制的研究

摘要

目的: H6N1亚型禽流感病毒在水禽和陆禽中广泛流行并反复传播到哺乳动物，其宿主范围进一步扩大，增加了适应性突变和基因重配的机率，并可能进化演变成感染人并在人群中传播的的新型流感病毒突变株，从而具有引发新一轮流感大爆发的潜能。更值得注意的是，该病毒的一些关键氨基酸已替换，这可能会增加人型SAα-2，6Gal受体的亲和力并有利于病毒在人复制。因此，除了预防高致病禽流感病毒H5N1、H7N9、H5N6之外，也不能忽视低致病性禽流感病毒H6N1亚型的潜在威胁。本文在前期研究的基础上，进一步探索H6N1亚型禽流感病毒是否具有在猪和人呼吸道组织复制的潜能并筛选出其有效复制的基因特点。 方法: 1.禽流感病毒的筛选及扩增将2株水禽鸭源性和3株陆禽鹌鹑源性的H6N1亚型禽流感病毒及课题组前期已筛选得到的1株H9N2亚型禽流感病毒（作阳性对照）进行鸡胚扩增，测定HA滴度，并将收获的尿囊液离心后分装在冻存管中，保存于-80℃超低温冰箱中待用。 2.EID50和TCID50实验检测禽流感病毒将病毒液进行10倍系列等比稀释应用EID50（鸡胚半数感染剂量）和TCID50(组织细胞半数感染量)实验，在体外感染实验前确定病毒感染接种的稀释度。 3.病毒体外感染猪呼吸道组织实验以安乐法处死巴马香猪后，迅速解剖、分离猪呼吸道组织（气管、支气管、肺组织）并切成小组织块，置于6孔细胞培养板中，将稀释的病毒液体外感染猪呼吸道组织，并在感染后各时间点收集组织培养液及组织块。鸡胚和MDCK细胞分离培养上清液及组织研磨液，HA检测鉴定，HE染色观察组织病理学变化以及免疫组化法检测病毒抗原的分布。 4.病毒体外感染人呼吸道组织实验收集我校直属医院临床相关手术中切除的新鲜人呼吸道组织（细支气管、肺组织）并切成小组织块，置于6孔细胞培养板中，将稀释的病毒液体外感染人呼吸道组织，并在感染后各时间点收集组织培养液及组织块。鸡胚和MDCK细胞分离培养上清液及组织研磨液，HA检测鉴定，HE染色观察组织病理学变化以及免疫组化法检测病毒抗原的分布。 5.病毒基因测序和筛选关键基因标记分别提取5株禽流感病毒的RNA，逆转录合成cDNA，PCR反应扩增，测序反应。用GCG10.2编辑和处理基因序列，Mega7.0和Bioedit7.0.9上进行序列比较和同源性分析。综合猪和人呼吸道体外感染试验和基因测序的实验结果，分析具有在猪和人呼吸道组织复制的病毒各基因片段的变化，最终筛选出病毒在猪和人呼吸道组织复制的基因特点，特别是关键分子标记。 结果: 1.EID50和TCID50实验检测禽流感病毒情况:应用EID50检测5株H6N1亚型禽流感病毒，发现病毒Qa/ST/22124/2005（简称ST22124）的EID50值最高，毒力最强;病毒Qa/ST/238/2000（简称ST238）和DK/JX/35634/2016（简称JX35634）的EID50值最低，毒力最弱。同时，应用TCID50实验检测5株H6N1亚型禽流感病毒，发现病毒ST22124的TCID50值最高，毒力最强;病毒JX35634的TCID50值最低，毒力最弱。 2.禽流感病毒H6N1在体外猪呼吸道组织的复制:鸡胚分离培养组织培养液和组织研磨上清液中病毒，培养液中HA滴度均大于256，且感染前后会出现滴度变化，其中以Qa/ST/3329/2001（简称ST3329）和ST22124两株病毒感染后产生的HA滴度较高。而在MDCK细胞分离培养中，HA滴度小于128或阴性。HE染色显示病毒感染气管和肺组织后均出现不同程度的组织结构破坏，气管黏膜上皮脱落坏死，肺泡细胞坏死。免疫组化检测显示肺组织部分和肺巨噬细胞内病毒NP抗原阳性，而气管和支气管仅出现个别细胞内病毒NP抗原阳性。其中ST3329和ST22124病毒株感染肺组织后，病毒NP抗原在细胞表达较多。 3.禽流感病毒H6N1在体外人呼吸道组织的复制:鸡胚分离培养组织培养液和组织研磨上清液中病毒，培养液中HA滴度均大于256，且感染前后也出现滴度变化，其中以ST22124和ST3329两株病毒感染后产生的HA滴度较高。而在MDCK细胞分离培养中，HA滴度小于128或阴性。HE染色显示病毒感染支气管和肺组织后均出现不同程度的组织结构破坏、肺泡上皮细胞坏死和少量炎性细胞浸润。免疫组化检测显示肺组织部分肺泡细胞和巨噬细胞内病毒NP抗原阳性，而在细支气管中，病毒NP抗原仅出现少量阳性。其中ST22124和ST3329两株病毒感染肺组织后，其病毒NP抗原在细胞表达较多。 4.禽流感病毒H6N1在猪和人复制的基因特点:HA基因氨基酸序列分析结果，5株H6N1病毒的HA裂解位点序列均为PQIETG/GL，仅有单个碱性氨基酸，表现为低致病性禽流感病毒的分子特征。陆禽鹌鹑Qa/ST/3329/2001（简称ST3329）和ST22124的HA出现P186S、S158T，而ST238仅出现S158T，JX35634仅出现S158T，结合ST22124和ST3329两株病毒易于在猪和人复制的特点，提示HA出现S158T或S158T、P186S双联突变有助于病毒具有感染猪和人的潜能。NA氨基酸序列分析发现，ST238、ST3329和ST22124三株陆禽动物源性病毒的NA基因颈部有19aa的缺失，其位点均位于第54-72位，这种NA颈部氨基酸的缺失有利于增强流感病毒对宿主的毒力和复制力。5株病毒PB2第627、701位均分别为谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)，且PB1-F2的第66位均为天冬酰胺(N)，未出现突变。 结论: 1.水禽鸭和陆禽鹌鹑H6N1亚型禽流感病毒在猪及人呼吸道组织有效复制，提示H6N1亚型禽流感病毒具有跨越种间屏障分别从水禽和陆禽直接感染猪及人的潜能，病毒在猪和人呼吸道组织中持续复制有助于病毒进化演变成具有感染人以及人际传播能力的新型流感病毒的可能。 2.陆禽鹌鹑H6N1亚型禽流感病毒ST22124和ST3329在猪和人的呼吸道组织中复制能力较强，属具有感染人潜能的病毒株。 3.H6N1亚型流感病毒均表现为低致病性禽流感病毒特征，但也存在与病毒毒力、宿主嗜性相关的基因突变，陆禽鹌鹑ST22124和ST3329的HA出现S158T、P186S双联突变、NA基因序列颈部第54-72位19aa缺失，结合该2株病毒均可在猪和人支气管和肺泡组织有效复制的结果，提示这些突变和缺失有利于陆禽H6N1病毒感染猪和人。