白腐菌胞外液增效木质纤维素酶解产糖体系的筛选与构建

摘要

白腐菌具备一套完善的胞外木质纤维素降解体系，在木质纤维素降解中具有一定优势，这为构建高效的复合酶解体系提供了可能。本研究系统地评价9株白腐菌及1株褐腐菌胞外提取液对纤维素酶水解几种木质纤维素基质的影响，在此基础上筛选出纤维素水解酶活性较强的菌株的胞外提取液与市售的纤维素酶构成复合酶解体系并对其进行评估筛选，对最佳的复合酶解体系进一步探究不同温度及配比对复合体系酶解效果的影响，并对其酶解条件进行优化。
　　本研究测定评估了9株白腐菌与1株褐腐菌液体发酵胞外提取液中各种木质纤维素降解酶的分泌特性，并评估了各菌株胞外液及胞外蛋白对纤维素酶酶解不同种类的木质纤维素基质产糖的影响。结果发现，Ganodermae sp.EN2，Irpex lacteus254，Echinodontiumtaxodii2538的胞外粗蛋白对纤维素酶的酶解存在增效作用，能显著提高木质纤维素酶解的初始反应速率，在酶解6h后，3种胞外蛋白分别对碱处理玉米秸秆、碱处理毛竹、碱处理硬木的酶解产糖提高了10.60％、15.82％、12.60％，22.85％、36.77％、21.39％与1.95％、34.75％、23.26％，并由此初步构建了复合酶解体系。
　　为了进一步探究白腐菌胞外蛋白对木质纤维素酶解的增效机理，以三种复合体系对经过不同方式预处理的木质纤维素基质进行酶解，以高效液相色谱法分析了酶解产物中各种单糖的产量。结果表明，Ganodermae sp.EN2胞外粗蛋白的加入提高了酶解体系中木糖的产量，从而增加了酶解体系总还原糖产量。I.lacteus254胞外粗蛋白的加入显著提高了纤维素的初始酶解速率，在对原始玉米秸秆、碱处理玉米秸秆、酸处理玉米秸秆的酶解过程中，反应1h体系中葡萄糖产量比对照分别提高了57.50％、36.78％、67.98％。E.taxodii2538的胞外粗蛋白对基质中纤维素的酶解有明显的增效作用，其构建的复合酶解体系在酶解原始玉米秸秆1h、6h与24 h时体系中葡萄糖产量较对照组分别提高了87.25％、15.96％、9.45％;在酶解碱处理玉米秸秆1h、6h与24 h时体系中葡萄糖产量较对照组分别提高了66.58％、28.15％与14.22％;在酶解酸处理玉米秸秆1h、6h与24 h时体系中葡萄糖产量较对照组分别提高了81.03％、32.40％、11.78％。综上所述，I.lacteus254、E.taxodii2538胞外粗蛋白均能够显著提高纤维素酶酶解基质中纤维素的反应速率，同时E.taxodii2538胞外粗蛋白提高了酶解体系的最终葡萄糖产量。
　　从工业应用的角度出发，尽量温和的预处理工艺、尽量低的纤维素酶酶负载是对木质纤维素酶解产糖的要求，因此进一步探究了基质的不同预处理程度、不同酶负载对E.taxodii2538胞外粗蛋白复合酶解体系的影响。并探究了不同温度及不同粗蛋白添加比例对解产糖效果的影响，对复合酶解体系进行了一定的优化。结果表明，在降低酶负载后，各酶解体系葡萄糖产量均出现一定程度的下降，但I.lacteus254、E.taxodii2538胞外粗蛋白复合体系葡萄糖产量的下降程度显著低于纯纤维素酶酶解体系，在酶负载降低50％后，三者对中度碱处理及碱处理基质酶解葡萄糖产量分别降低了才11.34％、15.93％、23.82％与7.75％、11.93％、14.82％，表明白腐菌的添加能够在一定程度上降低酶解体系对酶负载的需求量。对复合酶解体系比例进行初步优化后，以E.taxodii2538胞外粗蛋白构建的复合酶解体系最适比例为胞外粗蛋白总纤维素酶活力与商品纤维素酶活力的比值为1∶3，最适反应温度为48℃，在此条件下，48 h反应体系葡萄糖产量为624.52 mg/g基质，比对照提高12.73％。
　　通过以上评估筛选及优化，得到了以白腐菌E.taxodii2538胞外粗蛋白与商品纤维素酶构建的复合酶解体系，在降低纤维素酶用量的同时能够显著提高木质纤维素酶解葡萄糖产量，具有一定的应用前景。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 木质纤维素

1．1．1 木质纤维素的来源

1．1．2 木质纤维素的结构

1．1．3 木质纤维素的生物炼制

1．1．4 木质纤维素的酶解抗性

1．2 木质纤维素的预处理

1．2．1 木质纤维素的理化预处理

1．2．2 木质纤维素的生物预处理

1．3 纤维素酶与白腐菌胞外酶的复合酶解

1．3．1 白腐菌的胞外木质素降解酶

1．3．2 木质纤维素复合酶解的研究

1．4 研究目的与研究思路

第2章 白腐菌胞外酶活特性的评估

2．1 实验材料

2．1．1 菌株来源

2．1．2 木质纤维素基质

2．1．3 仪器与设备

2．1．4 主要试剂

2．1．5 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 菌株胞外液的制备

2．2．2 胞外酶活的测定

2．3 实验结果

2．3．1 胞外酶活的初步评估

2．3．2 菌株胞外液酶活变化规律的筛选

2．4 本章小结

第3章 白腐菌胞外液降解能力及增效效果的评估与筛选

3．1 实验材料

3．1．1 菌株来源

3．1．2 木质纤维素基质

3．1．3 仪器与设备

3．1．4 主要试剂

3．2 实验方法

3．2．1 胞外液的制备

3．2．2 酶活的测定

3．2．3 木质纤维素基质的碱处理

3．2．4 胞外液的浓缩

3．2．5 胞外液酶解体系的制备

3．2．6 胞外液与纤维素酶复合酶解体系的制备

3．2．7 酶解体系还原糖产量的测定

3．2．8 数据的统计分析

3．3 实验结果

3．3．1 浓缩胞外液酶活的测定

3．3．2 胞外液酶解产糖能力的评估

3．3．3 胞外液增效纤维素酶酶解产糖能力的筛选评估

3．4 本章小结

第4章 白腐菌胞外蛋白增效纤维素酶酶解的评估与机理研究

4．1 实验材料

4．1．1 菌株来源

4．1．2 木质纤维素基质

4．1．3 仪器与设备

4．1．4 主要试剂

4．2 实验方法

4．2．1 胞外液的制备

4．2．2 酶活的测定

4．2．3 木质纤维素基质的预处理

4．2．4 胞外粗蛋白的制备

4．2．5 胞外粗蛋白与纤维素酶复合酶解体系的制备

4．2．6 糖含量的测定

4．2．7 木质纤维素各组分含量的测定

4．2．8 数据统计分析

4．3 实验结果

4．3．1 各木质纤维素基质组分测定与分析

4．3．2 复合酶解体系中各木质纤维素降解酶活力分析

4．3．3 复合酶解体系酶解不同来源木质纤维素基质的研究

4．2．4 复合酶解体系酶解不同预处理木质纤维素基质的研究

4．4 本章小结

第5章 白腐菌胞外蛋白增效体系的优化

5．1 实验材料

5．1．1 菌株来源

5．1．2 木质纤维素基质

5．1．3 仪器与设备

5．1．4 主要试剂

5．2 实验方法

5．2．1 胞外液的制备

5．2．2 酶活的测定

5．2．3 木质纤维素基质的预处理

5．2．4 胞外粗蛋白的制备

5．2．5 不同比例的复合酶解体系的制备

5．2．6 不同酶负载的复合酶解体系的制备

5．2．7 酶解糖产量的测定

5．2．8 数据的统计分析

5．3 实验结果

5．3．1 不同酶负载及不同预处理程度对复合酶解体系的影响

5．3．2 复合酶解体系胞外粗蛋白添加比例的优化

5．4 本章小结

第6章 总结与展望

6．1 主要结论

6．2 存在问题

6．3 展望

参考文献

攻读硕士期间发表论文

致谢

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