野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个脂多糖合成相关基因的功能鉴定

摘要

该研究通过致病性试验,从已构建的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)8004的Tn5gusA5插入突变体库中筛选到一株致病力显著降低的突变体008G04.TAIL-PCR和测序分析表明,该突变体的Tn5gusA5插在与脂多糖合成相关的基因wxcB内.为研究wxcB基因与Xcc致病性的关系,利用自杀质粒pK18mob作为同源单交换整合质粒,获得了该基因的非极性突变体3512nk.聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,3512nk脂多糖O-抗原发生明显变化.胞外多糖产量为野生型8004的45.3％,相对致病力为野生型的10.7%.将PCR合成的wxcB全基因克隆至pLAFR3,导入突变体中能够使突变体的O-抗原合成恢复正常,相对致病力恢复为野生型的64.6%.有趣的是,互补菌株的胞外多糖产量比野生型提高了4倍.该研究表明,wxcB基因参与了脂多糖O-抗原、胞外多糖的生物合成,且与Xcc的致病性相关.

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1植物病原细菌Xcc的概述

1.2植物病原菌的致病生化因子

1.2.1多糖

1.2.2.毒素

1.2.3.生长激素

1.2.4.胞外酶

1.2.5.依赖于hrp基因的效应蛋白分子

1.3胞外多糖(EPS)的研究进展

1.3.1胞外多糖的结构

1.3.2胞外多糖的生物合成及调控

1.3.3胞外多糖与致病性

1.4脂多糖(LIPOPOLYSACCHARIDE，LPS)的研究进展

1.4.1脂多糖的基本结构和化学组成

1.4.2脂多糖的生物合成

1.4.3脂多糖的生物学功能

1.4.4 Xcc脂多糖研究进展

1.5本研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2培养基、培养条件及菌种保存

2.1.3常用抗菌素

2.1.4常用溶液、缓冲液

2.2方法

2.2.1 DNA的沉淀

2.2.2 DNA溶液中蛋白质及RNA的去除

2.2.3 DNA的凝胶电泳

2.2.4细菌总DNA的提取

2.2.5质粒的提取

2.2.6 DNA酶切

2.2.7 DNA的连接

2.2.8 DNA的电脉冲转化

2.2.9 PCR扩增DNA片段

2.2.10三亲本接合

2.2.11整合突变体的构建

2.2.12整合突变体的验证

2.2.13突变体的功能互补

2.2.14脂多糖(LPS)分析

2.2.15胞外多糖的检测

2.2.16胞外酶的检测

2.2.17致病性试验

2.2.18过敏反应试验

2.2.19细菌在寄主内的生长繁殖的测定

2.2.20细菌在培养基中的生长繁殖曲线的绘制

第三章结果与分析

3.1用TN5gusA5插入突变体初步筛选致病相关基因

3.2 wxcB基因的生物信息学分析

3.2.1 wxcB基因在基因组上的位置

3.2.2 wxcB基因演绎的氨基酸序列

3.2.3 wxcB基因推测蛋白的基本性质分析

3.2.4 wxcB基因推测蛋白的同源性比较

3.2.5Xcc B100 WXCB蛋白的结构功能域分析

3.3 wxcB基因整合突变体的构建

3.4 wxcB基因整合突变体的验证

3.5整合突变体的功能互补

3.6 wxcB基因功能鉴定

3.6.1检测致病力

3.6.2检测生长繁殖情况

3.6.3检测致病生化因子

第四章结论与讨论

4.1结论

4.2讨论

4.2.1 wxcB基因编码产物的功能预测

4.2.2功能互补试验的两点解释

参考文献

致谢