广西猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究

摘要

近来,广西一些养殖场频繁发生以母猪流产、死胎、木乃伊、仔猪呼吸道症状等为特征的流行性传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)所致.该研究应用针对PRRSV的N基因的特异性引物P1/P2,通过RT-PCR技术对从广西南宁市郊区收集的仔猪病料进行检测,结果为阳性.将材料接种于易感细胞—Marc-145细胞,经过6代盲传,结果出现了典型的细胞病理变化(CPE),与对照株病变相似,经鉴定为PRRSV,成功地分离出广西第一株PRRSV毒株,命名为GXA株,其毒价为10<'5.33>TCID<,50>/ml.参考VR-2332和CH-1a株基因序列,设计了3对引物E1/E2、M1/M2、N1/N2,分别扩增GXA株的E、M、N基因.并进行克隆和测序.结果分别扩增出大小为668bp、582bp和443bp的目的片段.应用DNAstar生物学软件对所测得的序列进行处理后,得到GXA株的E、M和N基因ORF全长分别为603nt、524nt和372nt,分别编码200、1 74和123个氨基酸.将此3个基因序列分别与国内外已发表的ATCC VR-2332、MLV、BJ-4和LV等1 3个毒株相应基因序列进行了同源性比较.将GXA株的E、M、N基因从重组质粒pMD-E、pMD-M、pMD-N中亚克隆至原核表达载体PET-32a上,构建了原核表达重组质粒PET-E、PET-M和PET-N,并通过酶切鉴定,证实构建成功.

目录

前言

一、病原学

1.1、PRRSV的基本特征

1.2、PRRSV遗传变异

1.3、PRRSV的培养特性

二、PRRSV的分子结构

2.1、基因组构成

2.2、两种基因型代表毒株基因组结构的比较

2.3、基因组结构与功能

三、PRRSV的免疫学特性

3.1、对免疫相关细胞的影响

3.2、细胞免疫

3.3、体液免疫

四、发病机制与病理组织学变化

4.1、发病机制

4.2、病理组织学变化

五、诊断

5.1、临床诊断

5.2、病毒分离

5.3、血清学诊断

六、免疫防制

6.1PRRSV灭活苗

6.2PRRSV弱毒苗

6.3PRRSV基因工程苗

七、PRRS流行病学研究

八、国内PRRS流行情况

材料与方法

一、材料

1.1、PRRS病料

1.2、引物

1.3、细胞系

1.4、质粒载体

1.5、菌种

1.6、试剂及配制

1.7、仪器

二、方法

2.1、实验方案

2.2、病料和病毒分离株阳性鉴定

2.3、病料中RNA的提取

2.4、反转录-聚合酶链式反应

2.5、PRRSV的分离与鉴定

2.6、RT-PCR扩增目的基因

2.7、PCR产物胶回收

2.8、DH5 α、BL21(DE3)感受态细胞的制备

2.9、基因克隆

2.10、基因测序

2.11、测序结果的处理与分析

2.12、构建原核表达重组质粒载体

结果

1、PRRS阳性病料的鉴定

2、GXA株的分离

2.1CPE显微镜观察及照片

2.2分离毒株TCID50测定

2.3GXA株的RT-PCR鉴定

3、各基因片段的扩增及回收

4、重组质粒的酶切及PCR鉴定

5、测序结果和比较分析

5.1国内外PRRSV毒株

5.2PRRSV GXA株E蛋白基因

5.3PRRSV GXA株M蛋白基因

5.4PRRSV GXA株N蛋白基因

6、原核表达质粒载体的构建及酶切鉴定

分析与讨论

1、引物特异性

2、连接与转化

3、结果的可靠性

4、PRRSV GXA株的分离

5、同源性分析

6、抗原变异

6.1E基因变异情况

6.2M基因变异情况

6.3N基因变异情况

7、构建原核表达质粒载体

结论

参考文献

致谢

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