牛链球菌L—乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

摘要

乳酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、制革、纺织、卷烟工业、化学工业、环保及农业等领域。本文以牛链球菌总DNA为模板，PCR扩增Streptococcus bovis的L-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhL)，构建重组质粒pSE-ldhL，并在大肠杆菌JMl09中表达。SDS-PAGE分析表明：有分子量约为36KD的特征蛋白条带出现。经紫外分光光度法测定，在重组菌株中能检测到L-(+)-乳酸脱氢酶活性，重组菌株的最高酶活力为168.2U/ml，高于对照菌的74.1U/ml的酶活。重组酶的最适反应温度范围为20℃～25℃，最适作用PH为5.0～5.5。经质粒稳定性的研究表明：重组质粒的稳定性达99.9﹪。成功地将牛链球菌ldhL基因引入大肠杆菌，在大肠杆菌中建立了一条新的代谢葡萄糖生成L-乳酸的途径。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1乳酸细菌

1.2根霉

1.3基因工程菌

1.4本研究的目的及意义

第二章L-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhL)在大肠杆菌中的表达

2.1实验材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 酶与试剂

2.1.3主要仪器设备

2.2方法与步骤

2.2.1 Streptococcus bovis的复苏培养

2.2.2菌种的保存

2.2.3 Streptococcus bovis基因组总DNA的制备

2.2.4 L-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhL)的克隆和表达载体的构建

2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.6质粒DNA的大量制备

2.2.7质粒DNA的小量制备

2.2.8 DNA的酶切与连接

2.2.9连接产物化学转化大肠杆菌感受态细胞

2.2.10阳性克隆的筛选和酶切验证

2.2.11重组子的质粒PCR验证

2.2.12外源片段在大肠杆菌中的诱导表达

2.2.13表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.14 L-(+)-乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定

2.2.15重组L-(+)-乳酸脱氢酶(LDH)性质的研究

2.2.16重组质粒pSE-ldhL稳定性的研究

2.3结果和分析

2.3.1 L-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhL)表达质粒的构建

2.3.2 L-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhL)的不完全序列分析

2.3.3表达产物的SDS-PAGE分析

2.3.4重组LDH活力测定分析

2.3.5重组LDH性质的分析

2.3.6重组质粒pSE-lhdL稳定性的分析

2.4讨论

2.4.1质粒的稳定性

2.4.2外源基因在大肠杆菌中的表达

第三章大肠杆菌中D-(-)-乳酸脱氢酶基因(ldhA)敲除的研究

3.1实验材料

3.1.1菌株与质粒

3.1.2酶与试剂

3.1.3主要仪器设备

3.2方法与步骤

3.2.1 Escherichia coli基因组总DNA的制备

3.2.2电穿孔大肠杆菌感受态细胞的制备

3.2.3 D-(-)-乳酸脱氢酶基因(ldhA)的引物设计和PCR扩增

3.2.4四环素抗性基因(tetr)的引物设计和PCR扩增

3.2.5 DNA的酶切与连接

3.2.6质粒DNA的转化

3.2.7阳性克隆的筛选和酶切验证

3.2.8重组质粒PCR验证

3.2.9 ldhA基因的置换DNA片段的制备

3.2.10电转化大肠杆菌JM109感受态细胞

3.2.11基因敲除菌株的初筛及PCR验证

3.3结果和分析

3.3.1 ldhA基因的克隆

3.3.2 retr基因的克隆

3.3.3置换型同源重组质粒pSE-ldhA-tetr的构建

3.4讨论

第四章结论与展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文