堆肥未培养微生物的宏基因组文库构建及新的木聚糖酶基因的克隆、鉴定和表达

摘要

本文对堆肥未培养微生物的宏基因组文库构建及新的木聚糖酶基因的克隆、鉴定和表达进行了研究。文章通过差速离心从自制堆肥样品中分离未培养微生物细胞，提取了其总DNA(metagenomic DNA)，末端平头化后，用柯斯质粒pWEB：：TNC为载体构建成了包含约5万个克隆的未培养微生物的宏基因组文库(metagenomiclibrary)，随机挑取其中的1 4个克隆提取质粒用BamHI酶切分析。结果显示所有的质粒都含有插入片段，最大为45kb，最小为25kb，平均大小为35kb，文库外源DNA总容量是1.8×106kb(1.8Gb)，14个质粒的酶切带型都不相同，说明文库克隆的DNA片段随机性比较大。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1未培养微生物

1.1未培养微生物的研究方法

1.2未培养微生物的宏基因组分析

2木聚糖以及木聚糖酶

2.1木聚糖及其化学结构

2.2木聚糖酶

2.3木聚糖酶的分类

2.4木聚糖酶的理化特性

2.5木聚糖酶的分子结构

2.6木聚糖酶的作用机理

2.7耐极性木聚糖酶(extramophilic xylanases)

2.8木聚糖酶基因的克隆和表达

3木聚糖酶的应用研究

3.1木聚糖酶在食品、医药行业中的应用

3.2木聚糖酶在饲料工业中的应用

3.3木聚糖酶在造纸工业中的应用

3.4木聚糖酶在其它领域中的应用

4研究的内容、目的和意义

第二章材料与方法

2.1菌株与质粒

2.2菌种保存

2.3培养基、培养条件和抗生素

2.3.1培养基

2.3.2培养条件

2.3.3抗生素

2.4常规溶液、缓冲液、酶及试剂

2.5质粒DNA的制备

2.5.1碱变性法提取质粒DNA

2.5.2碱变性法大量制备质粒DNA

2.6质粒DNA的纯化、定量与沉淀

2.6.1苯酚/氯仿抽提

2.6.2质粒DNA的沉淀与贮存

2.6.3分光光度法测定DNA浓度

2.7 DNA的酶切、电泳及DNA片段浓度测算

2.7.1 DNA酶切

2.7.2电泳及DNA片段浓度、大小测算

2.7.3 DNA片段的回收

2.8 DNA连接

2.8.1载体的脱磷酸化

2.8.2连接反应

2.9质粒DNA以及DNA连接产物的转化

2.9.1 CaCl2法快速制备E.coli的感受态细胞

2.9.2氯化铷法制备感受态细胞

2.9.3电脉冲转化法的感受态细胞的制备

2.9.4转化反应

2.10 SDS-PAGE

2.11自制堆肥的材料

2.12堆肥的堆制和管理

2.13堆肥未培养微生物宏基因组DNA的提取和纯化

2.13.1堆肥未培养微生物基因组DNA的提取

2.13.2堆肥未培养微生物宏基因组DNA的纯化

2.14堆肥未培养微生物宏基因组文库的构建

2.15文库的筛选和保存

2.16木聚糖酶基因的鉴定

2.16.1亚克隆分析及测序

2.16.2系统进化分析

2.1 7木聚糖酶基因的表达

第三章结果与分析

3.1自制堆肥未培养微生物总DNA的提取和纯化

3.2文库质粒的酶切分析

3.3文库的筛选

3.4木聚糖酶基因鉴定

3.4.1 pGXN1050和pGXN1051的亚克隆分析

3.4.2 umxyn11A和umxyn11B的序列分析

3.4.3 umxyn11A和umxyn11B的CMCase活性检测

3.5系统进化分析

3.6 umxyn11B的表达

3.6.1扩增umxyn11B基因的PCR引物设计及其扩增

3.6.2 umxyn11B的PCR产物的克隆及表达

3.7 umxyn11B基因在BL21(DE3)pLysS中的表达条件的研究

3.7.1诱导温度对表达的影响

3.7.2诱导剂量对表达的影响

3.7.3诱导时间对表达的影响

3.7.4 umxyn11B表达产物的可溶性分析

第四章结论与讨论

4.1堆肥未培养微生物的宏基因组文库的构建、筛选

4.2木聚糖酶基因鉴定及表达

参考文献

附录：参与的科研、取得的成果和发表的文章

致谢