一种新型半胱氨酸脱羧酶的基因的克隆以及生化性质的鉴定

摘要

极端微生物是一个巨大的潜在的优势基因资源库，未培养微生物研究是极端微生物研究的一个重要组成部分。现在国际微生物学界普遍认为未培养微生物在自然界土壤栖息群中占99％以上的资源。直接从自然环境体系中提取纯化宏基因组DNA构建文库是从分子生物学角度研究微生物基因资源的重要途径，这也是研究未培养微生物的生态、生理等特性的关键方法。近年来，环境体系宏基因组文库的构建为新型生物活性物质的筛选工作提供了丰富的直接的自然资源来源。目前从土壤样品中提取纯化宏基因组DNA的方法的技术正在不断完善中，而直接提取纯化碱性环境宏基因组DNA的方法很少，而采取直接提取纯化宏基因组．DNA构建文库研究独特的碱性污染环境微生物基因资源特别是未培养微生物基因资源的正式报道很少。 本研究工作从碱性污染环境体系中采集土壤，直接提取纯化土壤宏基因组DNA，所获得的粗制DNA产量为每克土壤样品10-30μg。接着构建了包含大约5，562个阳性克隆的碱性土壤16S rDNA文库，随机抽取的9个克隆测序后构建的系统进化树表明了碱性土壤环境微生物种群基因的多样性。然后纯化土壤宏基因组DNA后采用EcoRⅠ酶部分酶切处理，利用大肠杆菌DH5a作为宿主细胞，我们又构建了以pGEM-3Zf(+)为载体的DNA部分文库。该宏基因组文库大约包含30，000个左右的克隆。随机插入载体的外源DNA片段平均大小为3.5 kb左右。建库效率为从每克环境样品中获得6，000个左右的含随机外源DNA片段插入载体的克隆。 采取酶的活性筛选策略对文库进行筛选，我们从文库中筛选到了一批表达蛋白酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶的阳性克隆。采用对文库直接测序筛选的策略我们分离得到并注释了一批可能的新型的酶基因资源。我们对所注释得到的一个阳性克隆编号为pGXEC0426所携带的外源DNA片段所包含的可能的开放阅读框编码一种新型的L-半胱氨酸脱羧酶进行了深入的研究和阐述。这种可能的编码一种新型的L-半胱氨酸脱羧酶的基因被命名为undeclA，该基因由1077个核苷酸序列构成，编码由359个氨基酸组成的大小为38 kDa的蛋白质。该酶与来自Porphyromonas gingivalis W83的一种磷酸式泛酰巯基乙胺半胱氨酸脱羧酶有56％的同源性，70％的相似性。UndeclA氨基酸序列的分析比较揭示了UndeclA蛋白和属于HFCD家族的蛋白具有相似的黄素蛋白结合模式，保守的活性位点和半胱氨酸脱羧酶残基位点，因此，我们将UndeclA蛋白鉴定为HFCD蛋白家族的新成员。我们进一步在大肠杆菌系统中过量表达了UndeclA蛋白并最终纯化出了目标蛋白并进行了深入的酶学性质研究。Liquid Chromatography-MassSpectrometry(液质联用色谱分析)实验结果证实了L-半胱氨酸在UndeclA蛋白作用下脱羧生成了脱羧产物半胱胺。以L-半胱氨酸作为底物，该酶的最佳的作用温度为35℃，最适作用pH值为7.0左右。1 mM的Mg2+的浓度能够促进UndeclA蛋白的酶活表达，因此我们推测UndeclA蛋白的氨基酸序列具有金属离子Mg2+结合位点。在作用体系为35℃和pH7.0的条件下，该酶的表观米氏常数Km为0.5928 mM，最大反应速率Vmax为68.5μM/min，催化常数Kcat为4.57/min。 进一步的研究显示，UndeclA蛋白具有明显的HFCD蛋白家族底物结合簇序列特征。将UndeclA蛋白的His-30突变成Asn将导致整个基因的失活；将保守的底物结合簇ACGD模式序列中的丝氨酸残基Ser-113突变成Arg将导致UndeclA蛋白失去大部分活性。我们得出结论：His-30和Ser-113位点是UndeclA蛋白表达活性所必需的氨基酸。新型半胱氨酸脱羧酶UhdeclA的发现证实了宏基因组文库的克隆手段对发现新型酶的优越性。我们所构建的来自于碱性污染土壤的宏基因组文库也可以用于筛选其他工业上有应用前景的或者有学术研究价值的的新型酶基因。酶

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1微生物资源

1.2极端环境微生物

1.2.1极端环境微生物资源介绍

1.2.2极端碱性微生物的多样性

1.2.3适碱微生物作用机制机理研究

1.2.4极端嗜碱菌应用

1.2.5极端微生物的研究展望

1.3脱羧酶研究进展

1.3.1精氨酸脱羧酶

1.3.2组氨酸脱羧酶

1.3.3天(门)冬氨酸脱羧酶

1.3.4谷氨酸脱羧酶

1.3.5鸟氨酸脱羧酶

1.3.6赖氨酸脱羧酶

1.3.7亚磺酸盐半胱氨酸脱羧酶

1.3.8半胱氨酸脱羧酶与辅酶A

1.4未培养微生物研究概况

1.4.1未培养微生物发展概况

1.4.2未培养微生物研究的发展前景

1.4.3未培养微生物的研究方法

1.4.4构建宏基因组文库的载体的选择

1.4.5宏基因组文库的筛选策略

1.4.6提高获取目标序列的方法

1.4.7宏基因组文库构建的技术关键点

1.5本课题研究意义、技术路线和目标

第二章材料与方法

2.1菌株与质粒

2.2培养基及培养条件

2.2.1培养基

2.2.2培养条件

2.2.3菌体保存

2.3常用溶液、缓冲液

2.4主要仪器设备

2.5酶与制剂

2.6常用的抗生素及其浓度

2.7土壤样品来源

2.8土壤细菌的培养

2.9 DNA的提取

2.9.1快速碱裂解法提取质粒

2.9.2质粒DNA的大量提取

2.9.3质粒DNA的转化

2.10琼脂糖凝胶电泳

2.11电洗脱法回收DNA片段

2.12试剂盒法快速回收DNA片段

2.13 DNA的连接

2.13.1载体质粒DNA的去磷酸化

2.13.2 DNA连接

2.14 ABI DNA自动测序系统测定DNA序列

2.15文库的构建和保存

2.15.1环境样品宏基因组DNA的提取

2.15.2载体的制备

2.15.3 16S rDNA文库的构建和生物信息学分析

2.15.4宏基因组DNA文库的构建

2.15.5克隆子的鉴定以及分析

2.16宏基因组文库的筛选

2.16.1功能基因的活性筛选策略

2.16.2功能基因的直接测序筛选策略

2.16.3 Undec1A基因系统进化树的绘制

2.17功能基因在大肠杆菌系统中的表达

2.17.1表达载体的选择

2.17.2 PCR扩增DNA片段

2.17.3外源DNA片段在大肠杆菌中的诱导表达

2.17.4 Undec1A蛋白的粗酶液的制备

2.18功能基因的表达检测

2.18.1所用溶液

2.18.2 蛋白质样品的制备

2.18.3 SDS-PAGE蛋白质电泳

2.18.4亲和层析纯化目标蛋白

2.18.5金属亲和层析Ni-NTA的再生和活化

2.18.6 Undec1A蛋白的纯化

2.18.7蛋白质浓度标准曲线的绘制

2.19 L-半胱氨酸在蛋白Undec1A作用下的产物LC-MS分析

2.19.1作用体系和培养条件

2.19.2使用的仪器和色谱条件

2.20 HPLC技术分析L-半胱氨酸在蛋白Undec1A作用下的产物

2.20.1作用体系和培养环境

2.20.2使用的仪器和色谱条件

2.21 Undec1A蛋白的酶学性质测定

2.21.1作用底物浓度标准曲线的绘制

2.21.2 pH对Undec1A蛋白的活力的影响

2.21.3 Undec1A蛋白的pH的稳定性实验

2.21.4温度对Undec1A蛋白的活力的影响

2.21.5 Undec1A蛋白的热稳定性实验

2.21.6 Undec1A蛋白的活化能分析

2.21.7 Undec1A蛋白对不同底物的广泛性分析

2.21.8 Undec1A蛋白对不同金属离子的敏感性分析

2.21.9 Undec1A的Km和Vmax测定以及相关动力学数据分析

2.22 Undec1A蛋白的三维结构分析

2.22.1三维结构同源建模方法

2.23 Undec1A蛋白的定点突变

2.23.1重叠PCR法(Over-lap PCR)定点突变的方法

2.23.2突变点的选择

2.23.3 Undec1A的基因定点突变的PCR引物设计和扩增

2.23.4 Undec1A-His30M和Undec1A-Ser113M基因的重组转化

2.23.5 Undec1A-His30M和Undec1A-Ser113M表达重组子的筛选验证

2.23.6突变酶的纯化以及酶学性质的检测

2.24 Undec1A基因GENBANK登录号

第三章碱性污染土壤宏基因组DNA的提取纯化和遗传基因多样性分析

3.1引言

3.2碱性污染土壤宏基因组DNA的提取和纯化

3.3土壤宏基因组16S RDNA的扩增

3.4碱性污染土壤16S RDNA文库的构建

3.5 16S RDNA的测序和生物信息学分析

3.6结论

3.7 讨论

第四章 碱性污染土壤宏基因组文库的构建

4.1引言

4.2载体的制备

4.3 DNA文库的构建

4.4 DNA文库随机部分转化子测序结果和分析

4.5结论

4.6讨论

第五章 新型酶基因的克隆和分析

5.1引言

5.2蛋白酶基因的克隆

5.3淀粉酶基因的克隆

5.4 β-葡萄糖苷酶基因的克隆

5.5新型L-半胱氨酸脱羧酶基因的克隆

5.6 PGEXCO426测序结果

5.7 Undec1A基因的序列分析

5.8 Undec1A基因编码的蛋白产物的氨基酸序列分析

5.9 Undec1A基因编码的蛋白产物的亲疏水性分析

5.10 Undec1A基因编码的蛋白产物的跨膜结构分析

5.11 UNDEC1A基因编码的蛋白产物的氨基酸功能域结构分析

5.12 Undec1A基因编码的蛋白产物的氨基酸序列同源性分析

5.12 Undec1A基因编码的蛋白产物的进化关系分析

5.13结论

5.14 讨论

第六章 Undec1A基因在大肠杆菌系统中的表达

6.1引言

6.2扩增Undec1A基因的PCR引物设计

6.3 Undec1A基因的PCR扩增

6.4 Undec1A基因的PCR产物的克隆以及表达

6.4.1 Undec1A基因的PCR产物的克隆以及载体的构建

6.4.2 Undec1A基因在E.coli Tuner (DE3) pLac I中的表达分析

6.4.3 Undec1A蛋白的纯化以及检测

6.5结论

6.6讨论

第七章Undec1A蛋白的生化性质的鉴定和分析

7.1引言

7.2产物的LC-MS/MS分析

7.3 HPLC于产物的含量的分析

7.4 Undec1A蛋白在不同PH值下的酶活和对PH值的耐受性分析

7.5 Undec1A蛋白在不同温度下的酶活和对温度的耐受性分析

7.6 Undec1A蛋白的活化能分析

7.7 Undec1A蛋白对温度的敏感性分析

7.8 Undec1A蛋白对不同底物的广泛性分析

7.9 Undec1A蛋白对不同金属离子的敏感性分析

7.10 Undec1A蛋白的KM的测定

7.11 Undec1A蛋白的比活力测定

7.12 Undec1A蛋白动力学数据分析

7.13 Undec1A蛋白的活性位点分析

7.14 Undec1A蛋白的突变位点的选择和突变酶Undec1A-HIS30M和Undec1A-SER113M的纯化

7.15突变酶Undec1A-HIS30M并Undec1A-SER113M的酶活检测

7.16结论

7.17讨论

第八章 讨论和展望

8.1碱性污染土壤宏基因组DNA的提取和纯化

8.2碱性污染土壤环境体系遗传基因的多样性分析

8.3碱性污染土壤未培养微生物宏基因组的构建和筛选

8.4新型L-半胱氨酸脱羧酶基因(Undec1A)的生物信息学分析

8.5 Undec1A蛋白的酶学特性研究

8.6对新型L-半胱氨酸脱羧酶Undec1A下一步研究的设想

8.7本研究工作的创新点

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间所发表的学术论文和研究成果