全局调控蛋白RsmA在十字花科黑腐病菌的致病及其他细胞过程中的作用研究

摘要

RsmA(Repressor of Secondary Metabolism)/CsrA(Carbon Storage Regulator)蛋白是一类RNA结合蛋白。在细菌中，它作为转录后全局调控因子参与包括细胞次生代谢以及动植物病原菌的致病过程等许多细胞过程的调控。目前，已在许多动物病原菌中证实RsmA/CsrA参与它们的致病过程，但在植物病原菌中，除了在E. carotovora中证实了RsmA是一个负的致病调控因子外，RsmA/CsrA在其它植物病原菌中的功能还不清楚。在本研究中，我们研究了rsmAXcc在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathvar campestris，Xcc)中的作用。我们发现，rsmAXcc的缺失突变体DM2506完全丧失了在寄主满身红萝卜上的致病力和非寄主辣椒ECW-10R上引发HR反应的能力；其胞外纤维素酶，淀粉酶和EPS的产量较野生型显著降低。此外，该突变体还表现出游动性丧失、胞内的糖原累积量增加，以及细胞的粘附性和聚集性增强。全基因组芯片杂交和半定量反转录PCR(Semi-RT-PCR)分析结果显示，编码Ⅲ型分泌系统(Type three secretionsystem，T3SS)和T3SS效应物的基因，以及编码一个能驱散细胞聚集体的酶一内切β-1,4-甘露糖(endo-β-1,4-mannanase)的基因manA的转录水平，在rsmAXcc缺失突变体DM2506中显著下降。这结果说明，在Xcc中，rsmAXcc在包括致病在内的多种细胞过程发挥重要作用。 为了确定RsmAXcc蛋白分子中对其生物学功能起重要作用的氨基酸残基，我们采用丙氨酸置换方法，试图对组成RsmAXcc的每一个氨基酸残基进行单点突变。由于时间有限，目前我们只完成了N-末端的第2～7位氨基酸残基的功能分析。结果发现这些氨基酸残基的突变都造成了RsmAXcc蛋白生物学功能的丧失，证明第2～7位氨基酸残基都是RsmAXcc蛋白生物学功能所必需的。 RsmA/CsrA蛋白的调控机制在大肠杆菌(Escherichia coli)研究得较为透彻。为了了解Xcc的RsmAXcc的调控机理是否与和E. coli CsrA相似，我们用大肠杆菌的csrA基因(csrAEcoli)去互补rsmAXcc缺失突变体，并对所得的互补菌进行了表型分析。结果发现CsrAEcoli能够完全互补rsmAXcc缺失突变体的所有表型，说明RsmAXcc的调控机制可能和E.coli CsrA相似。

目录

文摘

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论文说明：缩写表

声明

第一章前言

1.1植物病原细菌概述

1.1.1土壤杆菌属(Agrobacterium)

1.1.2欧文氏杆菌属(Erwinia)

1.1.3假单胞杆菌属(Pseudomonas)

1.1.4罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)

1.1.5黄单胞杆菌属(Xanthomonas)

1.1.6木质部小菌属(Xylella)

1.1.7棒形杆菌属(Clavibacter)

1.2植物病原细菌致病分子机理研究进展

1.2.1胞外酶及胞外酶产生相关基因

1.2.2胞外多糖及胞外多糖产生相关基因

1.2.3脂多糖及脂多糖合成相关基因

1.2.4植物毒素及植物毒素产生相关基因

1.2.5 Ⅲ型效应物及Ⅲ型效应物合成、转运相关基因

1.3植物病原细菌的致病调控研究进展

1.4 Rsm/Csr转录后全局调控系统

1.5本研究的主要目的及意义

第二章材料与方法

2.1供试菌株和质粒

2.2常用抗生素

2.3细菌培养基及菌株培养条件

2.3.1大肠杆菌

2.3.2黄单胞菌

2.4菌种保存

2.5常用试剂和缓冲液

2.6本研究所用的引物

2.7质粒DNA的提取(碱裂解法)

2.8质粒DNA的转化

2.8.1质粒DNA的化学转化法

2.8.2质粒DNA的电脉冲转化

2.9载体脱磷酸化处理

2.10 DNA连接

2.11细菌总DNA的提取

2.12琼脂糖凝胶电泳

2.13 DNA的纯化

2.14 DNA浓度和纯度

2.15 DNA的酶切及产物纯化

2.16从琼脂糖凝胶中分离和纯化DNA片段的回收

2.17细菌总RNA的提取

2.17.1提取总RNA前的准备及注意事项

2.17.2热酚法提取总RNA

2.17.3试剂盒RNA的提取

2.18 RNA的定量与纯度

2.18.1 RNA的纯度和浓度

2.18.2 RNA的电泳图谱

2.18.3保温试验

2.19总RNA的DNase再处理

2.20 cDNA的合成

2.21 PCR扩增反应

2.21.1 PCR引物的设计

2.21.2 PCR反应

2.21.3 Semi-RT-PCR

2.22 DNA测序

2.23无筛选标记的缺失突变体的构建

2.24突变体的互补

2.25引物介导的定点突变

2.26突变体营养缺陷型检测

2.27Xcc鞭毛石炭酸复红鞭毛染色法观察

2.28细菌细胞内糖原积累的检测

2.29生物膜合成检测

2.30游动性检测

2.31胞外多糖的检测

2.32胞外酶的检测

2.32.1平板法检测胞外酶

2.32.2胞外酶精确定量检测

2.33致病性检测

2.34过敏反应(HR)检测

2.35芯片杂交的方法

2.36 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备

第三章RsmAxcc的生物学功能鉴定及生物学功能必须的氨基酸残基的确定

3.1引言

3.2缺失突变体的构建

3.3 rsmAxcc缺失突变体的互补

3.4缺失突变体的表型分析

3.4.1 rsmAxcc的缺失不影响Xcc在基本培养基上的生长

3.4.2 rsmAxcc是Xcc在寄主上致病和非寄主上产生HR反应所必需的

3.4.3 rsmAxcc的缺失导致Xcc的胞外纤维素酶、胞外淀粉酶和EPS产量降低

3.4.4 rsmAxcc抑制生物膜形成和胞内糖原积累，促进细胞运动

3.4.5 rsmAxcc是Xcc鞭毛合成所必需的

3.5 RsmAxcc分子中对生物学功能有重要作用的氨基酸残基的鉴定

3.5.1带有单个氨基酸丙氨酸置换突变的rsmAxcc基因的获得以及在pLAFR6上的克隆

3.5.2将重组质粒导入缺失突变体DM2506

3.5.3 rsmAxcc点突变互补菌株的表型检测

3.6小结

第四章RsmAxcc调控元的鉴定

4.1引言

4.2 Xcc 8004全基因组芯片的制作

4.3总RNA的分离和eDNA的合成

4.4芯片杂交与数据分析

4.5芯片结果的Semi-RT-PCR的验证

4.6受RsmAxcc调控的基因的功能分类

4.6.1受RsmAxcc调控的碳源代谢相关基因

4.6.2受RsmAxcc调控的T3ss分泌途径相关的基因

4.6.3受RsmAxcc调控的运动相关基因

4.6.4受RsmAxcc调控的调控基因

4.7小结

第五章大肠杆菌cstA基因(csrAEcoli)互补rsmAxcc缺失突变体分析

5.1引言

5.2互补菌株的构建

5.3互补菌株的表型分析

5.3.1致病力和HR反应检测

5.3.2细胞内糖原的积累、生物膜的形成，细胞运动性检测

5.3.3胞外多糖和胞外酶检测

5.3.4 CsrAEcoli强烈抑制Xcc胞外蛋白酶的产生

5.4 CsrAEcoli抑制Xcc胞外蛋白酶所必需的氨基酸残基的鉴定

5.4.1 CsrAEcoliC-末端非保守区是CsrAtcoli抑制Xcc蛋白酶产生必需的

5.4.2 K54、S60和Y61是CsrAEcoli抑制Xcc蛋白酶产生所必需的

5.5小结

第六章总结与讨论

6.1总结

6.2讨论

6.3后续工作

6.3.1 RsmAxcc直接调控靶标的鉴定

6.3.2与RsmAxcc相互作用的小RNA的鉴定

6.3.3调控rsmAxcc的基因的鉴定

参考文献

附录一

致谢

攻读博士学位期间完成的研究论文