十字花科黑腐病菌致病相关的基因的用途

摘要

本发明提供了一种与十字花科黑腐病病菌致病相关的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，该基因是编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列；具体地，是序列表中序列1所示的DNA序列。本发明鉴定了十字花科黑腐病菌致病相关的基因XC2038，能够为防治十字花科植物黑腐病病害提供药物靶标。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病原细菌的致病相关基因及其用途，尤其涉及十字花科 黑腐病病菌致病相关的基因及其用途。

背景技术

植物病害一直是农作物减产、品质降低的主要因素之一。随着病原菌对 药物抗性的增强，农药用量在不断增加，这不仅加剧了环境污染、药物残留， 也大大增加了农业成本，因此，亟待研发新的防病治病策略和新型的无公害 药物。弄清植物病原菌侵染寄主的遗传机制是开发新型药物和防病策略的关 键。

十字花科黑腐病菌(Xcc，Xanthomonas campestris pv.campestris)是一 种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的革兰氏阴性细菌。该菌能 在寄主的任何生长期通过水孔、气孔或伤口侵入植物体内，引起十字花科黑 腐病病害，寄主包括甘蓝、花椰菜、大白菜、萝卜以及油菜等。典型的黑腐 病症状是在叶缘上形成V字形病斑。随着病斑的扩大，叶脉变黑，因而被称 为黑腐病。黑腐病被认为是对十字花科植物危害最为严重的病害，尤其在热 带和亚热带地区，温度和湿度都适宜于该菌的生长繁殖，因此发病更加严重。 由于遗传稳定性和遗传可操作性，十字花科黑腐病菌一直被用作研究微生物 与植物相互作用分子机理的模式细菌。因此，鉴定与十字花科黑腐病菌致病 相关的基因，对防治植物病害具有显著的意义。

目前，，在十字花科黑腐病菌致病变种Xcc8004的基因组中，发现编号为 XC2038的基因的开放阅读框(ORF，Open Reading Frame)所编码的蛋白注 释为假定蛋白(Hypothetical Protein)。假定蛋白是指因功能未知而未被鉴定 的新基因编码的蛋白。在Xcc8004的基因组中发现注释为假定蛋白的ORF 较多。目前，已鉴定到被注释为假定蛋白且与十字花科黑腐病菌致病相关的 新基因，如XC0241基因，即被鉴定为致病相关的III型效应物基因。对于 XC2038基因的功能目前却鲜有报道。

参考文献

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发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种十字花科黑腐病菌致病相关的基 因的用途，通过鉴定该基因为防治十字花科植物黑腐病病害提供药物靶标。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种与十字花科黑腐病病菌致病 相关的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，该基因是编码序列表 中序列2所示蛋白质的DNA序列。

优选地，该基因是序列表中序列1所示的DNA序列。

本发明鉴定了十字花科黑腐病菌致病相关的基因XC2038，能够为防治 十字花科植物黑腐病病害提供药物靶标。

附图说明

图1为本发明鉴定的XC2038基因克隆的酶切电泳图谱；

图2为在本发明鉴定的XC2038基因插入突变体164H09的PCR验证凝 胶图；

图3为在本发明鉴定的XC2038基因插入突变体164H09的胞外多糖、 泳动性及生物聚膜表型检测；

图4为本发明鉴定的XC2038基因插入突变体164H09的致病性试验。

具体实施方式

以下结合附图和优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。应该 理解，以下列举的实施例仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术 方案的限制。

本发明旨在提供与十字花科黑腐病菌致病相关的基因XC2038。首先确 定XC2038基因与十字花科黑腐病致病性的关系，并由此得到该基因在防治 植物十字花科黑腐病方面的用途。

本发明所提供的与十字花科黑腐病菌致病相关的基因XC2038，是编码 序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列。

并且，该基因是序列表中序列1所示的DNA序列。

目前，该与十字花科黑腐病菌致病相关的基因XC2038(以下简称 XC2038基因)的序列已在美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center  of Biotechnology Information)公布，其基因组序列号为NC_007086，该基因 编码蛋白序列号YP_243119；携带该基因的质粒pCXC2038已在广西大学亚 热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室保存。

序列表中序列1的DNA是十字花科黑腐病菌8004菌株的基因，由960 个碱基组成，含完整的XC2038基因，自5’端的第498至875位核苷酸为该 基因的ORF，自5’端的第498至500位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自 5’端的第876至878位核苷酸为终止密码子TGA。

序列表中序列2的蛋白质是XC2038基因编码的产物，由126个氨基酸 组成。该蛋白质预测分子量为13926.73道尔顿，等电点为6.41。

本发明通过以下方法步骤鉴定XC2038基因与十字花科黑腐病致病相 关：

(一)十字花科黑腐病菌突变体库的构建

以大肠杆菌和Xcc之间的穿梭质粒pLAFR1为载体将Tn5gusA5引入Xcc 野生型菌株8004，然后通过引入不相容质粒pPH1JI驱赶pLAFR1，通过卡 那霉素作为抗生素，抗性标记筛选Xcc::Tn5gusA5插入突变体，结合Xcc 全基因组序列和TAIL-PCR(Thermal Asymetric Interlaced-PCR)技术，确定 Tn5gusA5在基因组上的插入位置，并对插入位置进行PCR验证。

通过考察突变体的致病性、胞外酶活性、胞外多糖合成等表型的变化， 筛选致病相关基因，本发明涉及其中一个新的致病相关基因，即XC2038基 因(编码假定蛋白)，其插入突变体编号为164H09(该编号为自命名编号， 即十字花科黑腐病菌突变体库的XC2038基因的插入突变体的编号)。

(二)XC2038基因的克隆及序列测定

根据XC2038的基因序列，设计引物(XC2038F：GGGGAATTC GCGCCAAGCAACGGACAGACG和XC2038R：GGGGGATCC AACACGACGCCGACCAGCACG)，以十字花科黑腐病菌8004菌株总DNA 为模板，用PCR法扩增该基因全长序列，并将其克隆至克隆载体pGEM3Zf(+) 中，用双脱氧核苷酸法在ABI377DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列。 将测序验证正确的XC2038基因序列克隆至穿梭载体pLAFRJ中，获得了含 该基因的重组质粒pCXC2038。

将该质粒用EcoR I、BamH I酶切，除了一个22kb的载体条带外，还有 一个960bp的外源片段，请参见图1，其中，M1：λ/HindIII2标准DNA，片 段大小从大到小依次为：23.1kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.4kb，2.0kb；M2：100bp 标准DNA，片段大小从大到小依次为：3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，1kb，0.9kb，0.8kb， 07kb等；1为XC2038基因片段(960bp)。

(三)在XC2038基因插入突变体164H09的验证

对插入突变体164H09进行TAIL-PCR测序定位，发现其插在XC2038 基因内。

用转座子Tn5上sp1侧的一条引物 (CCGCCGAAGAGAACACAGATTTA)和下游基因XC2037的一条引物 (AGTTCGGAGGAATCACGCGG)配对进行PCR验证，产物预期大小837 bp。请参见图2，其中，1为100bp标准DNA；2为XC2038基因插入突变 体164H09(837bp)。

(四)XC2038基因插入突变体164H09的胞外多糖、泳动性及生物聚膜 表型检测

将野生型菌株8004，XC2038突变体菌株164H09和互补菌株C164H09 培养于NYGB培养基(每升含蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，甘油20.0g， pH7.0)中，28℃摇床过夜培养。

对于胞外多糖的检测用NYGB培养基将培养好的待测菌液的OD₆₀₀值调 为一致，用移液器精确取2μl的培养物，分别接种于含2％葡萄糖的NYGA (NYGB培养基加约3％的琼脂粉)平板上，在28℃培养箱中培养，3天后 再将该平板放置于培养箱外，见光培养2～5天，通过比较菌落的形态大小对 EPS的产量进行比较；

对于泳动性的检测用NYGB培养基将培养好的待测菌液的OD₆₀₀值调为 一致，各菌体取5μl，点在0.3％琼脂糖的NYGA平板上，28℃静置培养48 小时后观察并照相记录；对于生物聚膜的检测用NYGB培养基将培养好的待 测菌液的OD₆₀₀值调为一致，按照10％的比例转接至LB液体培养基内，28℃ 静置培养5-7天后，观察并记录结果。

结果表明，XC2038突变体菌株164H09影响胞外多糖的产量、菌株的泳 动性及生物聚膜的形成，而其互补株C164H09能很好的恢复至野生型的水 平。由于胞外多糖的产量、菌株的泳动性及生物聚膜的形成都是病原菌重要 的致病生化因子，这说明XC2038与致病相关；请参见图3，其中，对象A 为野生型；对象B为XC2038基因插入突变体164H09；对象C为XC2038 基因插入突变体的互补株C164H09。

(五)XC2038基因插入突变体164H09后的致病性检测

试验所用寄主植物为萝卜苗(种名为Raphanus sativus L.var.radiculus  Pers.)，所用的接种方法为剪叶法。将野生型菌株8004、XC2038基因插入 突变体164H09和互补菌株C164H09在28℃下进行液体培养15-18小时。

用NYGB稀释至OD₆₀₀＝0.001，用灭菌剪刀在菌液中浸泡5秒钟后，在 健康叶片距叶尖1-2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5秒钟，被接种 的植物在25-30℃培养一周后观察结果，正对照选用十字花科黑腐病菌8004 菌株。

上述致病试验表明，XC2038基因的插入突变体164H09的致病性为零， 参见图4，而突变体的互补株C164H09能将降低的致病性很好的恢复到野生 型的水平。这说明XC2038基因是一个重要的致病相关基因。在图4中，对 象A为野生型；对象B为XC2038基因插入突变体164H09；对象C为XC2038 基因插入突变体164H09的互补株C164H09。

在本发明的上述方法步骤中所用到的材料包括：

大肠杆菌(Escherichia coli)株系JM109；

载体PCEM-3Zf(+)购自Promega公司；

pLAFR1、pPH1JI、pLAFRJ为本研究室保存的(参见参考文献7)柯斯 质粒；

限制性内切酶、修饰酶等试剂购自Promega、Stratagene、QIAGEN公司、 日本制药株式会社。