广西猪增生性肠炎病原的初步研究

摘要

猪增生性肠炎(PPE)是由胞内劳森氏菌(Lawsonia Intracellularis,LI)引起的接触性传染病，是一种具有重要经济意义的世界性疾病。该病呈全球性流行，国内临床可疑病例有增多趋势，猪群感染率高。胞内劳森氏菌宿主广泛，是猪肠道疾病综合征(PEDC)的关键性病原之一，对全球养猪业造成巨大经济损失。因此，了解PPE的流行情况并研究其病原，对防制该病和促进养猪业的健康发展具有重要意义。 本研究优化了猪增生性肠炎的PCR诊断方法，能用于活体检测。从疑似病变的猪回肠中扩增出胞内劳森氏菌的基因，与GenBank上各株胞内劳森氏菌核苷酸同源性在98.9％-100％之间，证实广西猪群存在猪胞内劳森氏菌的感染；对广西猪群增生性肠炎调查显示，屠宰猪和断奶仔猪平均感染率分别为15.6％和13.5％，应引起重视。 以感染猪回肠粘膜为材料，成功将本研究所得的GXNN株胞内劳森氏菌接种到兔体。动物感染试验表明，猪源胞内劳森氏菌可以用兔体接种保存，该菌可以人工感染小鼠；GXNN株胞内劳森氏菌对兔子和小鼠致病性相似，初步建立其动物感染模型。将GXNN株胞内劳森氏菌接种到猪后能复制出PPE，表明该菌是PPE的病原。对人工感染猪组织进行HE切片染色，证实胞内劳森氏菌可以引起猪回肠、结肠腺窝上皮细胞的增生。 设计特异性引物，克隆GXNN株胞内劳森氏菌的16SrRNA基因。核苷酸同源性分析显示，GXNN株与不同动物源性胞内劳森氏菌16SrRNA核苷酸同源性在98.4％～100％；与其他种类原核微生物16SrRNA核苷酸同源性在71.8％～88.6％。 克隆GXNN株胞内劳森氏菌的三个外膜蛋白基因和一个表面脂蛋白基因(LI1022，LI1024，LI0902，LI0235)，与己发表菌株AM180252核苷酸同源性分别为99.8％，99.5％，99.8％，99.8％；氨基酸同源性分别为99.4％，98.8％，99.3％，98.9％。分别将四个基因连接至PET32a+载体并转化至BL21，经酶切鉴定和序列测定后表明插入位置正确。分别挑取单个阳性菌落，于20℃下以终浓度1.0mmol/L IPTG诱导5h，并用抗6xHis标签单抗进行Western blotting检测，结果表明PET32a+-LI1022、PET32a+-LI0902融合蛋白得到表达。用感染兔血清对PET32a+-LI1022融合蛋白进行Western blotting检测，初步表明该蛋白具有抗原性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分前言

1.1猪增生性肠炎研究进展

1.1.1胞内劳森氏菌病原学

1.1.2流行病学

1.1.3致病机理与免疫反应

1.1.4诊断与防控

1.2研究目的和意义

1.3研究路线

第二部分实验研究

一猪胞内劳森氏菌PCR检测方法的优化及广西猪增生性肠炎流行情况的初步调查

1.1材料与试剂

1.2方法与步骤

1.3结果

1.4小结与讨论

二猪胞内劳森氏菌动物感染模型的初步建立及猪增生性肠炎的复制

2.1材料与试剂

2.2方法与步骤

2.3结果与分析

2.4小结与讨论

三人工感染猪增生性肠炎组织病理学初步研究

3.1材料与方法

3.2结果

3.3小结与讨论

四猪胞内劳森氏菌GXNN株16srRNA基因的扩增及其分类探讨

4.1材料与试剂

4.2方法与步骤

4.3结果与分析

4.4小结与讨论

五猪胞内劳森氏菌GXNN株抗原性候选基因的克隆与原核表达及Western blotting分析

5.1材料与试剂

5.2方法与步骤

5.3结果与分析

5.4小结与讨论

六结论

附录

参考文献

致谢

论文发表情况