禽呼肠孤病毒M1、M2基因克隆序列分析与病毒受体的确定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立

摘要

禽呼肠孤病毒(ARV)主要感染鸡和火鸡，在鸡群中普遍存在，常与其他疾病混合感染，临床上表现多种病症，导致鸡的生长能力下降及死亡率升高。为了更有效的预防和控制ARV，降低ARV对养禽业的危害，本课题开展了ARV M1、M2基因的克隆与序列分析及病毒受体的初步研究，并应用SYBR Green Ⅰ染料建立了ARV的荧光定量RT-PCR检测方法。 根据GenBank ARV M1、M2基因序列，设计两对引物，分别对9株ARV的M1、M2基因进行了RT-PCR扩增、克隆及序列测定。结果显示，所构建的克隆质粒中含相应的M1、M2蛋白基因完整ORF，大小分别为2199bp和2031bp，分别编码732和676个氨基酸的μA和μB蛋白；经分析，测序的9株ARV M1、M2基因核苷酸及其推导的氨基酸序列具有高度的同源性，M1基因在99.3％～99.7％和99.3％～99.7％之间，M2基因在98.7％～99.9％和97.8％～99.9％之间。与GenBank上其他呼肠孤病毒株包括美国分离株(2408)、日本分离株(OS161)和4株台湾分离株(1017-1、601G、750505、916SI)进行比较，结果表明所有毒株M1基因的核苷酸和氨基酸同源性都较高，分别在88.3％～100％和97.0％～100％之间；M2基因与2408株和1017-1株的核苷酸和氨基酸同源性高，均在98％以上，而与其他分离株的核苷酸和氨基酸同源性较低，仅在69.5％～72.0％之间和85.5％～89.5％之间；遗传进化树分析表明M2基因中多数台湾株和日本株变异大。 将培养的鸡胚成纤维细胞接种ARV S1133病毒株以增殖病毒，待细胞病变达60％-80％时收毒，冻融三次后通过差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化病毒，经紫外分光法测病毒蛋白浓度为6.25mg/mL。提纯鸡胚原代肝细胞膜蛋白测浓度为16mg/mL。取24uL浓度为16ug/uL的膜蛋白经SDS-PAGE电泳后，采用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)即膜蛋白电泳后转移到硝酸纤维素膜上依次与病毒、抗血清和酶标二抗作用显出病毒受体结合带的方法结合Bandscan分析病毒受体分子量为68.6kDa。 根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域设计一对扩增片断为147bp的特异性引物，将PCR扩增的σC基因片段，连接pGM-T载体，重组质粒经筛选、PCR鉴定及测序进一步证实，表明σC片段正确克隆入pGM-T载体中，命名为pGM-T-σC。提取质粒用Sal I单酶切得到线性化转录模板DNA，体外转录出RNA，以体外转录的RNA为标准品制定标准曲线，应用SYBR Green I染料建立了检测禽呼肠孤病毒的一步法荧光定量RT-PCR方法。结果表明，制作的标准曲线定量浓度范围宽，在5.2×102-5.2×109拷贝/uL之间呈良好的线性关系，可检测到每个反应相当于5.2×102个拷贝的标准品RNA；该方法特异性好，与NDV、IBDV、MG都不反应。 本课题开展了ARV M1、M2基因的克隆与序列分析及甩VOPBA鉴定了ARV受体的分子量，为进一步研究病毒各蛋白问的相互作用、病毒与宿主的相互关系及基因组与致病性的关系提供重要参考。应用SYBR Green I染料成功建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法，为ARV的流行病学、致病机理研究及快速诊断与防治等方面提供了重要的技术支撑。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

第一节禽呼肠孤病毒的研究进展

1概况

2病原特征

3基因组和蛋白

4诊断

5问题与展望

第二节病毒受体的研究进展

1病毒受体概念

2受体特征

3病毒受体研究意义

4确定病毒受体的研究方法

5 ARV受体研究展望与存在问题

第三节荧光定量PCR研究进展

1荧光定量PCR定量原理

2荧光PCR的分类

3荧光PCR仪

4荧光定量PCR技术的应用

第二章禽呼肠孤病毒M1、M2基因的克隆与序列分析

1材料与方法

2结果

2.1 ARV M1、M2基因的RT-PCR扩增

2.2 ARV MI、M2基因的克隆及鉴定

2.3测序结果

2.4 M1、M2基因核苷酸序列和氨基酸比较分析

2.5 Ml、M2基因核苷酸遗传进化树分析

3.小结与讨论

第三章禽呼肠孤病毒受体的确定

1材料和方法

2结果

2.1病毒增殖与纯化

2.2病毒蛋白浓度的测定

2.3鸡胚肝细胞膜蛋白的提取及浓度测定

2.4膜蛋白电泳、转印及ARV受体分子量

3小结与讨论

第四章禽呼肠孤病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

1材料与方法

2结果

2.1体外转录RNA标准品的制备

2.2荧光RT-PCR方法的建立及优化

2.3特异性试验结果

2.4敏感性比较

2.5组内重复性结果

2.6稳定性试验结果

2.7人工感染鸡病毒的检测

3小结与讨论

第五章结论

参考文献

致谢

个人简历

攻读硕士学位期间所发表的学术论文