甘蔗乙烯受体ERS基因全长cDNA克隆与植物表达载体构建

摘要

在桂糖28号和园林3号生长后期，用浓度为600mg/L乙烯利叶面喷施，3d、9d、19d、29d、45d测定乙烯释放量、蔗糖代谢相关酶活性及蔗糖分含量。结果表明：蔗糖代谢三个关键酶活性变化与其相应叶片乙烯释放量呈负相关，与对应中茎段蔗糖分呈正相关；乙烯利诱导两品种叶片乙烯释放量增幅与其相应叶位SPS、AI酶活性增幅和对应茎段蔗糖分积累一致，与其相应叶位SS和NI酶活性增幅刚好相反。
　　 根据水稻和玉米等植物乙烯受体基因保守区设计引物，从甘蔗cDNA文库中克隆到1222bp ERS基因片段。根据该片段设计两对末端扩增特异引物，利用RACE-PCR技术获得该片段5’端和3’端序列。经拼接得到甘蔗ERS基因全长cDNA。该基因长2243bp，具有一个1902bp的完整读码框，启动子ATG位于19bp，终止子TAA位于1920bp，推导编码633个氨基酸。系统进化分析表明，该基因推导的氨基酸与其它植物乙烯受体基因推导的氨基酸有71％-97％的同源性；并与禾本科植物首先聚类，其次与芭蕉科和兰科植物聚类，最后与双子叶植物聚类，与植物形态的系统进化结果一致。功能预测表明，甘蔗ERS基因编码的蛋白属于不稳定的疏水蛋白和非分泌蛋白，可能定位于叶绿体和线粒体中，作为膜锚定信号发挥信号肽作用。
　　 甘蔗基因组DNA经SaocⅠ、 KpnⅠ、NcoⅠ内切酶消化后，以甘蔗ERS基因片段为探针进行Southern杂交，检测出甘蔗ERS基因在基因组中是单拷贝的。
　　 根据甘蔗ERS序列设计特异引物，通过RT-PCR克隆到甘蔗ERS编码区1914bp的cDNA片段，然后正向插入植物表达载体pBI121的BamHI+ Xbal位点，初步构建了甘蔗ERS基因的正义植物表达载体pBI-ERS。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1乙烯对植物的调控作用

1.1.1控梢促花

1.1.2提高品质

1.1.3促进成熟

1.1.4催落

1.1.5增强植物的抗逆性

1.2乙烯调控植物生长发育的机理研究

1.2.1乙烯生物合成的诱导调控

1.2.2乙烯信号传导途径

1.3植物乙烯受体基因的研究进展

1.3.1植物乙烯受体基因的克隆现状

1.3.2乙烯受体的表达

1.4乙烯受体基因遗传转化的研究进展

1.5乙烯调控甘蔗的机理研究进展

1.5.1乙烯利对甘蔗的调控及在甘蔗生产上的应用

1.5.2乙烯利对甘蔗调控机理的研究进展

1.6本研究的目的意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1试验材料

2.1.2药品和试剂(盒)

2.1.3主要试验仪器

2.2试验设计

2.3试验方法

2.3.1乙烯释放量的测定方法(范业庚，)

2.3.2蔗糖代谢相关酶活性的测定

2.3.3甘蔗糖分分析

2.3.4甘蔗乙烯受体基因ERS cDA全长的克隆

2.3.5甘蔗ERS基因编码区cDNA的克隆与植物表达载体构建

2.3.6 Southern杂交

3结果与分析

3.1乙烯利处理后乙烯释放量的变化分析

3.1.1不同叶位乙烯释放量的变化

3.1.2不同茎段乙烯释放量的变化

3.2乙烯利处理后蔗叶蔗糖代谢相关酶活性的变化分析

3.2.1蔗糖合成酶(SS)活性的变化

3.2.2蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性的变化

3.2.3 中性转化酶(NI)活性的变化

3.2.4酸性转化酶(AI)活性的变化

3.3乙烯利处理后甘蔗茎糖分含量的变化分析

3.4 RNA的完整性

3.5甘蔗ERS基因cDNA全长的克隆与鉴定

3.5.1甘蔗ERS基因cDNA片段的克隆和序列测定

3.5.2甘蔗ERS基因3’端的克隆和序列测定

3.5.3甘蔗ERS基因5’端的克隆和序列测定

3.5.4甘蔗ERS基因全长cDNA的拼接与分析

3.5.5甘蔗ERS基因蛋白性质与功能的预测

3.6甘蔗ERS基因编码区cDNA的克隆与植物表达载体构建

3.6.1编码区PCR产物的鉴定

3.6.2甘蔗ERS编码区cDNA的序列比较分析

3.6.3甘蔗ERS编码区cDNA植物表达载体的鉴定和分析

3.7.甘蔗ERS基因的Southern杂交

4讨论

4.1叶片与茎段的乙烯释放量变化规律

4.2茎的乙烯释放量与蔗糖分积累的关系

4.3乙烯释放量与蔗糖代谢关键酶的关系

4.4蔗糖分与蔗糖代谢关键酶的关系

4.5甘蔗ERS基因PCR扩增体系的优化

4.6甘蔗乙烯受体ERS基因全长cDNA的克隆策略

4.7甘蔗ERS基因片段的Southern印迹杂交

4.8甘蔗ERS基因植物表达载体的构建

5结论与展望

5.1结论

5.2展望

致谢

参考文献