水牛乳腺上皮细胞分离培养和永生化的初步研究

摘要

1．探讨了水牛乳腺上皮细胞体外培养的生物学特性。从屠宰场取回的泌乳期水牛乳腺组织，采用组织块培养法进行培养，经胰蛋白酶差异消化法纯化得到水牛乳腺上皮细胞，然后对其生物学特性进行检测。结果发现：(1)用组织块培养法和胰蛋白酶差异消化法纯化得到的水牛乳腺上皮细胞具典型的多角形，可传代培养20代；(2)得到的水牛乳腺上皮细胞具有正常的水牛染色体数(n=48)，经角蛋白18免疫荧光染色细胞被特异性染上绿色荧光；(3)应用RT-PCR对乳腺上皮细胞特异表达的β-酪蛋白进行检测，诱导培养液培养的原代、第1代、第3代，以及冷冻保存的第3代水牛乳腺上皮细胞均能检测到β-酪蛋白的表达，但是冷冻保存的第5代，以及培养至第10代的水牛乳腺上皮细胞未能检测到β-酪蛋白的表达，未加诱导液培养的第3代水牛乳腺上皮细胞未能检测到β-酪蛋白的表达。
　　 2．探讨了用SV40病毒T基因对水牛乳腺上皮细胞永生化诱导的效果。扩增克隆了SV40病毒T基因并定向克隆到pEGFP-C1，构建了真核表达载体pEGFP-C1-T。用脂质体法转染第3、4代水牛乳腺上皮细胞，经G418筛选后挑取阳性克隆扩大培养。结果发现：(1)转染后的水牛乳腺上皮细胞表达EGFP，应用RT-PCR检测到T基因的表达，经PCR检测表明T基因整合到细胞基因组；(2)筛选出的细胞克隆增殖能力没有显著增强，细胞形态塌陷，传代几次后便无法继续增殖；(3)应用RT-PCR未能检测到筛选后的水牛乳腺上皮细胞表达β-酪蛋白。
　　 结论：(1)分离培养的为水牛乳腺上皮细胞，具有正常的染色体倍数，能在体外传代；(2)培养的水牛乳腺上皮细胞能够在一定的培养条件下合成β-酪蛋白，但随着培养时间的延长其逐渐丧失合成β-酪蛋白能力。(3)应用构建的SV40病毒T基因真核表达转染，未能获得永生化的水牛乳腺上皮细胞。