食蟹猴支持细胞分离、培养、鉴定及增殖与凋亡研究

摘要

为了研究食蟹猴睾丸组织的形态特征、支持细胞在体外培养的生长特性及增殖凋亡情况，本实验以性成熟前的雄性食蟹猴为实验材料，采用三酶两步法对睾丸组织进行消化，利用离心速率的不同以及差异贴壁原理对支持细胞进行分离、培养，利用多种特异性染色方法（HE染色、油红染色、Feu1gen染色）和透射电镜对支持细胞进行鉴定；同时，利用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法及原位末端标记法（TUNEL检测法）对所分离培养出的支持细胞进行增殖与凋亡研究。主要研究结果如下：
　　 ①采用三酶两步法，可以比较快捷的得到单细胞悬液，1g食蟹猴睾丸组织平均所获得的细胞总数为1.6×108个，平均细胞存活率为93％。利用离心速率不同及差异贴壁原理，可以将睾丸生精细胞、间质细胞或其他的非支持细胞除掉，从而达到纯化支持细胞的目的。
　　 ②支持细胞接种Sh后，换液重新培养后开始贴壁生长。第二天至第四天，细胞数量显著增加，细胞形态良好，细胞突起连成网状，细胞核及胞内颗粒物清晰，第五天后，细胞生长速率下降，细胞形态变差，胞内空泡增多。支持细胞体外培养周期为1-7d，对数生长期为2-3d，可传2-4代。
　　 ③透射电镜观察结果显示：支持细胞形态完整，电子密度较低，多为圆形或长椭圆形，细胞核呈不规则圆形，核膜上有较多的皱褶，表现为明显的加厚圈，核仁大而明显，核仁周围存在有特异性结构卫星小体，细胞质丰富，可见大量的线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体和空泡等。
　　 睾丸组织HE染色结果显示：支持细胞呈长梭形，附于基膜生长，细胞核位于底部，多为椭圆形；支持细胞可为两侧的各级生精细胞提供营养物质，起到保护的作用。
　　 ④通过多种染色方法可对支持细胞进行鉴定：在HE染色中细胞呈梭形或多边形，两端有两个或四周有多个明显的突起，细胞核明显、清晰，染成淡蓝色，胞浆淡染呈粉红色；在油红染色中，细胞核染成蓝色，胞质淡染，高倍镜下可见胞质中的空泡染成柔和的粉色或红色，油红染色显示出支持细胞的特征结构：空泡——脂质小滴；在Feulgen染色中，支持细胞形态明显，其中胞质不着色，核内淡染，可见一个无着色的圆形或椭圆形的空圈，在其周围有不明显的淡染颗粒，即为核仁周围的卫星小体（双极小体），此为支持细胞的特征结构。
　　 ⑤MTT比色法检测不同血清浓度对支持细胞的增殖影响结果显示：5％血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响与15％、20％的血清浓度差异极显著(P＜0.01)，与10％的血清浓度差异不显著（P＞0.05），10％血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响与15％、20％的血清浓度差异极显著(P＜0.01)，15％血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响与20％的血清浓度差异不显著（P＞0.05），得出15％血清浓度为食蟹猴支持细胞的生长最佳浓度。
　　 ⑥TUNEL原位末端检测法结果显示体外培养的支持细胞在没有外界因素刺激的条件下，都会自主产生凋亡，但凋亡率较低，属于机体正常生理现象。