丙酮丁醇梭菌ldhL基因的克隆及在大肠杆菌中的表达和产乳酸发酵条件的优化

摘要

随着聚乳酸应用越来越广泛，聚乳酸产业也得到了高速发展，而L-乳酸是聚乳酸合成的前体，也引起人们的高度重视，而工业化生产L-酸主要是通过微生物发酵法，但微生物发酵法的不足之处最主要就是L-乳酸的分离纯化，因为在L-乳酸发酵过程中往往伴随着D-乳酸或混合乳酸的产生，对L-乳酸下游的分离纯化造成了很大的困难。如果通过基因工程的手段，构建一株只产生L-乳酸的基因工程菌，这些问题便会迎刃而解，本实验利用基因工程手段对基因工程菌发酵产高纯度的L-乳酸途径进行了成功探索。
　　 本课题从丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)中克隆到L-乳酸脱氢酶基因，简称ldhL，连接到表达载体pSE380上，命名为pSE3801dhL,并将其转化到丙酮酸裂解酶基因和D-乳酸脱氢酶基因缺陷的Escherichia coli FMJ144中进行表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达产物的分子量大小约为34KD，对菌体进行超声破胞处理测其粗酶液中L-乳酸脱氢酶的酶活力为42.4U/ml，该酶的最适pH值是6.4，最适反应温度是25℃。初步摇瓶发酵后用高效液相色谱检测分析L-乳酸产量约为2.4g/L，产物中不含D-乳酸，不需要再进行手性分离。
　　 运用单因素实验对大肠杆菌产L-乳酸的发酵培养条件进行了初步优化，确定了最佳发酵条件为2.5％蛋白胨、2％酵母粉、2.5％氯化钠、4％葡萄糖、5mmol/L IPTG、pH值为8.0、0.1％接种量、诱导温度为30℃、0.3％硫酸镁，优化后发酵液中L.乳酸的含量达到8.2g/L，是优化前的3.4倍。通过Plackett-Burman实验确定了对发酵L-乳酸含量有明显影响的三个因素为葡萄糖、酵母粉和蛋白胨，从而为以后在工业上生物法生产高纯度的L-乳酸提供了很好的方法和思路。