应用精子载体法体外生产转基因猪胚胎的技术研究

摘要

本研究探讨了精子载体法体外生产转基因胚胎的多个影响因素，尝试应用SMGT+IVF和SMGT+ICSI生产转基因胚胎，以期建立一个高效的以猪精子为载体的转基因技术平台，为将来转基因猪的商业化奠定科研基础。
　　 第一部分通过对SMGT+IVF法体外生产转基因胚胎的研究，探讨了洗精液、外源DNA孵育时间、孵育温度三个因素对转基因胚胎后期发育的影响。试验一探讨了不同洗精液处理精子后对猪转基因胚胎发育的影响，结果表明：PFM洗涤处理组发育到2-细胞和8-细胞胚胎的比例都高于DPBS组和对照组(67.90％Vs.60.76％和63.10％，27.16％Vs.15.19％和22.62％)；而三组胚胎的囊胚发育率之间差异不显著，以PFM处理组效果较好。试验二研究了外源DNA与精子孵育时间对猪胚胎发育的影响：30min、lh、2h和3h组别之间胚胎发育到2-细胞、8-细胞的比例和囊胚发育率差异没有显著差异，孵育2h组得到2.85％的阳性胚胎率。试验三关于不同孵育温度对猪胚胎发育的影响结果表明：外源DNA与精子孵育26℃组的2-细胞率、囊胚率、阳性胚胎率都是最高的，分别为61.54％、12.31％和3.08％，其8-细胞期的胚胎比例(35.38％)显著高于17℃和38.5℃组(17.91％和18.84％，P<0.05)。
　　 第二部分试验通过在体外预先处理好猪精子，再将猪精子与外源DNA(pPGK l-Fat l-EGFP)在一定条件下进行孵育，探讨精子载体法在体外生产转基因猪胚胎的应用。试验一精子质膜完整性对转基因猪胚胎发育影响的结果表明，可以通过不同方法对精子质膜的检验；冻融精子SMGT+ICSI的效率达到14.74％，显著高于活精子组3.45％(P<0.05)。试验二探讨了操作台的温度对猪ICSI胚胎发育的影响，结果表明：注射台碰度38.5℃组得到的8-胞率是42.03％,显著高于26℃和32℃(25.00％和22.86％,P<0.05)；385℃组得到8.70％的阳性胚胎率。试验三探讨了6-DMAP不同处理时间对转基因猪胚胎发育的影响：3h组的2-细胞率、8-细胞率、囊胚率核阳性胚胎率分别为50.67％、24.00％、13.33％和5.33％，高于2h、4h、5h组；各试验组(2h、3h、4h、5h)之间差异不显著，但显著差异于对照组(P<0.05)。试验四是应用精子载体法体外生产转基因猪胚胎，结果表明SMGT+ICSI法得到的4-细胞率、8-细胞率和阳性胚胎率分别为58.11％、37.84％和9.46％，高于SMGT+IVF组和对照组；其囊胚率显著高于SMGT+IVF组(27.03％Vs10.96％，P<0.05)。
　　 结论：应用精子载体法( SMGT+IVF)体外生产转基因猪胚胎，采用受精液(PFM)进行充分洗涤，在26℃温度下精子与外源DNA共孵育2h;预先将猪精子冻融后，38.5℃的操作台温度下进行ICSI，之后在6-DMAP液中激活3h获得较高的转基因效率；应用精子载体法(SMGT+ICSI)体外生产转基因猪胚胎效果较好。