qRT-PCR检测马立克氏病病毒gL、gI和meq基因mRNA方法的建立

摘要

马立克氏病病毒I型(MDV-1)在鸡体内的感染分为四个期：早期溶细胞感染期(early cytolytic infection)、潜伏期(latency)、第二次溶细胞期（secondary cytolytic infection）和肿瘤形成期(development of tumors)。不同毒力MDV-1的潜伏期存在明显差异，vMDV开始于6、7、8dpi，vvMDV开始于10-14dpi，而vv+MDV开始于14-16dpi。gL和gI蛋白是MDV的两种囊膜蛋白，在溶细胞期大量表达，而在潜伏期极少表达；meq(Marek'sEcoRI Q)是MDV-1特有的致瘤基因之一，主要在潜伏期表达。因此，gL、gI和meq基因的mRNA转录水平可以作为判断MDV感染期的指标。
　　 病毒编码的microRNA(miRNA)于2004年被首次发现。MDV编码的miRNA(mdv-miR)M4被证明与肿瘤的发生有密切关系并能调节免疫反应；miR-6～miR-8则推测是源于LAT的miRNA，可以下调细胞的转化生长因子的表达，具有抗细胞凋亡的作用。这些研究成果证明，mdv-miRNA与肿瘤的发生存在着密切关系，肿瘤特异性和组织特异性的miRNA表达谱可作为细胞转化的重要生物学指标。为了研究不同毒力MDV编码的miRNAs在感染的潜伏期(latency)的表达差异，课题试图建立用于检测MDV-lgL、gI和meq基因mRNA的荧光定量PCR(quantitative reverse-transcriptase PCR，qRT-PCR)方法，为以这些基因在感染细胞内mRNA转录水平作为为识别病毒溶细胞期和潜伏期的指标提供工具。
　　 参照已发表的资料而设计的引物，以感染vvMDV广西分离株YL040920的鸡胚成纤维细胞单层(CEF)基因组DNA为模板进行PCR，扩增出包含gL、gI、meq以及内参基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的长片段产物，纯化后连接pGM-T载体，转化大肠杆菌后，筛选阳性克隆，增菌抽提质粒。通过PCR和测序检验，证明已成功构建pGM-T-gL、paM-T-gI、pGM-T-meq和pGM-T-GAPD，重组质粒，可作为下一步构建标准曲线用的标准品使用。
　　 利用Primer6.0软件，针对YL040920株的gL、gI、meq和GAPDH基因序列的保守区域设计了4对特异性引物，用于构建qRT-PCR标准曲线和样品检测。以10倍梯度浓度的gL、gI、meq和GAPDH基因重组质粒标准品DNA为模板进行SYBR Green I法qPCR反应，建立了相应的标准曲线及其直线回归方程。在该反应体系和反应条件下，4条标准曲线的灵敏度达到10-1000copies/μL，标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系，相关系数(R2)均超过0.98。结果表明，已成功建立了检测MDV-1感染鸡体内基因gL、gI、meq和GAPDH基因mRNA的动态变化的qRT-PCR标准曲线。
　　 本课题成功建立了用于检测gL、gI和meq基因mRNA转录水平差异的qRT-PCR方法，可作为判断MDV-1不同感染期的依据，为下一步研究MDV不同毒力株的miRNA在肿瘤组织中的表达差异提供了工具，同时本方法也可用于鉴定MDV分离毒株的毒力。