广西小土窝螺的核糖体DNA和线粒体基因组学研究

摘要

本论文的第一部分应用PCR扩增和DNA序列分析方法，以采自广西梧州、桂林、北海、河池、南宁和百色等地的小土窝螺为研究对象，对小土窝螺核糖体基因间隔区(ITS)进行了DNA遗传多态性及种系发育分析，以期找到小土窝螺分子分类学、种群遗传关系研究的遗传标记。结果表明：广西各地区的小土窝螺ITS序列的相似性在95.7％-100％(ITS-1)及90.5％-100％(ITS-2)，而与其他椎实螺科的螺体的相似度均低于55％，这说明广西地区的小土窝螺的种内变异远小于与其他螺的种间差异，同时也说明了ITS-1和ITS-2均可以作为种水平以上的遗传变异标记，可以用于小土窝螺与其他椎实螺之间的鉴定。
　　 本研究的第二部分建立了小土窝螺的特异性PCR鉴定方法。以已获得的小土窝螺ITS-1基因序列，设计了小土窝螺的特异性引物GPu/GPd，，用疑似截口土蜗、椭圆萝卜螺等作为对照螺。采用已建立的特异性PCR检测方法对采自梧州、桂林、南宁等六地经过形态学鉴定的共108份小土窝螺样品进行了检验。敏感性试验结果显示最小DNA检测量为0.12ng。本检测方法具有特异、敏感、简便、快捷等优点，对小土窝螺的种类的鉴定以及对吸虫类鉴别诊断和分子流行病学调查具有重要的应用价值。
　　 本论文的第三部分研究了小土窝螺的线粒体rrnL基因和线粒体全基因组。第一节对广西地区不同种群的小土窝螺线粒体的rrnL基因部分序列进行PCR扩增、SSCP分析、测序及分析，结果得到有效长度为273bp的prrnL序列，其种群间变异为0-4.9％。而种系发育分析显示不能将小土窝螺不同的种群区分开来，说明其不适合作为小土窝螺的种群遗传标记。
　　 第二节完成了小土窝螺的线粒体全基因组序列测定及分析。在比较和分析肺腮亚纲的线粒体全基因组序列之后，利用coxl，rrnL，cox3，nadl和cytb共5个线粒体DNA小片段设计引物，采用长PCR方法分别扩增出长度约2-7kb的5个有重叠序列的片段，经克隆转化和测序后获得小土窝螺线粒体基因组的全序列，并对其结构特点及遗传进化关系进行分析。结果显示：小土窝螺的线粒体基因组全长为13768bp，A+T含量为72.67％;小土窝螺线粒体全基因组由13个蛋白质基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因组成。小土窝螺的线粒体全基因组中存在较多的小片段重叠区和基因间隔区。蛋白编码基因排序方式与已报道线粒体全基因组的基眼目、柄眼目的螺种完全一致，与柄眼目的螺种Albinariacoerulea仅是cox3和nad4基因位置颠倒，其他蛋白编码基因排列方式完全一致。在13个编码蛋白质的基因中，以ATG和ATA作为蛋白质翻译的起始密码子；多数蛋白质翻译的终止密码子为TAA，其次是TAG。
　　 以钉螺为外群，以线粒体DNA序列作为遗传标记，重构了小土窝螺的系统发育关系。结果显示：小土窝螺单独成一分支，与扁卷螺关系最近。
　　 本论文首次研究了小土窝螺的ITS及线粒体全基因组序列，研究结果不仅丰富了腹足纲螺类的ITS及线粒体全基因组序列，同时为对吸虫中间宿主螺类的遗传进化等方面的进一步研究奠定了基础。