全基因组研究十字花科黑腐病菌双组份感受蛋白基因的功能

摘要

十字花科黑腐病菌，学名野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestrispv.campestris,Xcc)，是一种革兰氏阴性菌，它是引起十字花科植物黑腐病的病原，也是研究植物与微生物互作的模式菌株之一。Xcc通过水孔或伤口感染植物，在导管中定殖，沿叶脉从叶缘形成V型的坏死病斑，给农业生产造成了严重的损失。Xcc8004编码了106个双组份调控系统基因，其中包括感受蛋白基因58个和反应调节蛋白基因48个，属于杂合蛋白基因的有14个，这些基因负责感受外界的信号并作出反应。为了研究这些双组份信号转导系统基因的生物学功能，我们对58个感受蛋白基因进行了突变研究。根据本实验室Xcc8004突变体库信息，通过分子验证得到51个感受蛋白基因的突变体，包括Tn5gusA5插入突变体和整合突变体。我们通过pK18mob同源单交换的方式或同源双交换的方式构建了其余7个感受蛋白基因的突变体。其中XC_0635、XC0728、XC_0730、XC0818、XC1414和XC2579基因为整合突变体，XC_1382基因为基于pK18mobsacB的缺失突变体。我们对所有突变体进行了胞外酶活性和游动性的检测，发现22个基因与蛋白酶产量有关；22个基因与淀粉酶产量有关；9个基因与纤维素酶产量有关；14个基因与游动性有关。通过对感受蛋白基因突变体在寄主满身红萝卜上的致病力检测，我们发现：致病力下降50％的基因有9个；通过对感受蛋白基因突变体在非寄主辣椒上的过敏反应(HR)检测，我们发现了15个基因的突变引起了HR的延迟；4个基因的突变体没有明显HR反应。为了研究这些基因与环境信号及环境胁迫的关系，我们通过突变体点板的方法，对重金属离子、有机溶剂、渗透压和蛋白质变性剂胁迫进行检测，发现了34个基因与重金属抗性有关；23个基因与渗透压抗性有关；11个基因与有机溶剂抗性有关；14个基因与蛋白质变性剂有。RT-PCR结果显示，33个基因在各种胁迫下表达量降低，3个基因在某些胁追下表达量升高，7个基因表达量不变。为了进一步确认感受蛋白基因的功能，我们对其中的XC_2129、XC_2456、XC_3068、XC_3118、XC_3125做功能性互补，其中XC_2129和XC_3118互补获得成功。得出结论XC_2129影响细菌胞外淀粉酶、胞外蛋白酶的产量和致病力；XC_3118影响细菌的游动性和致病力。在这个如此重要的植物致病菌中，本研究关于十字花科黑腐病菌感受蛋白基因的突变和突变体表型检测为进一步阐明病原菌信号转导、致病调控网络的研究提供了参考。