猪星状病毒分离鉴定和分子流行病学调查及生物学特性研究

摘要

星状病毒(Astrovirus，AstV)属于人兽共患病病原，与多种动物的腹泻性疾病有关，目前广泛分布于世界各地。星状病毒常同冠状病毒、轮状病毒、嵌杯状病毒及其它肠道病毒混合感染造成急性胃肠炎，尤其对小孩及幼畜危害最大。本研究对猪星状病毒进行分离鉴定和分子流行病学调查及生物学特性研究，将为今后预防猪星状病毒感染和传播提供实验方法和手段。
　　 通过对广西某猪场经RT-nPCR检测呈猪星状病毒阳性的粪样进行病毒分离，获得两株能在PK-15细胞上增殖，并能使该细胞变大、胞浆内出现颗粒，最后细胞破碎、脱落等细胞病变的病毒；在电镜下观察，该病毒呈典型的星状结构，直径约28～35nm;动物实验显示，攻毒猪出现温和性腹泻，体重减轻，肠系膜淋巴结肿大和肠绒毛变短等临床症状和在绒毛上皮细胞层及绒毛腔有大量淋巴细胞及少量巨噬细胞浸润等病理变化。病毒的成功分离，为猪星状病毒分子生物学以及致病机制的研究提供材料。
　　 应用RT-nPCR方法，对采自广西7个市县27个不同规模化猪场和广东湛江2个不同规模化猪场共315份猪腹泻样品进行检测，结果显示猪场阳性率达82.8％(24/29)；样品阳性率达40.3％(127/315)；0～30日龄的小猪感染率最高，达44.9％(53/118)；春季(2～4月)感染率最高，为54.3％(38/70)。调查结果表明，猪群中普遍存在猪星状病毒感染。另外，本研究克隆所得46株PAstVs核苷酸同源性为84.6％～100％，氨基酸同源性为51.1％～100％，遗传进化分析显示克隆所得46株PAstVs均属于猪星状病毒Ⅰ型，且又可分为5个亚群。这是首次对我国猪场进行大规模猪星状病毒分子流行病学研究。
　　 参考GenBank上发表的猪星状病毒亚基因组序列，设计1对引物，对猪星状病毒广西流行株衣壳蛋白基因进行扩增，最终克隆得到PAstV/NNJG7株的衣壳蛋白完整序列。基因分析发现，其ORF2全长2358bp，编码786个氨基酸；与PAstV-Ⅰ型参考株核苷酸同源性最高，为77.3％～79.4％；在ORFlb和ORF2连接处有一段高度保守的序列，在ORF23′端有一段83个核苷酸长度的非翻译序列及一个含43个核苷酸高度保守的茎环样基序；遗传进化分析发现，该克隆株属于PAstV-Ⅰ型；用DNAStar和ExPasy生物学软件对PAstV/NNJG7蛋白进行抗原性预测，最终确定10个区域为抗原表位区。本研究不仅丰富了猪星状病毒衣壳蛋白基因序列，也为基因疫苗和诊断试剂盒的研制提供材料及理论依据。