30株野生Bt菌株的大质粒谱分析及晶体蛋白毒杀美洲钩虫(Necator americanus)的活性鉴定

摘要

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)通常包含有一组能够自我复制的染色体外DNA分子或称质粒，迄今发现的Cry蛋白均是由质粒DNA所编码。质粒的数量和大小因菌株而不同。通过凝胶电泳解析质粒谱型是描述菌株特征的一种重要手段。
　　 本研究通过脉冲场凝胶电泳方法分析了30株野生Bt菌株的大质粒的谱带情况，供试的30株野生Bt菌株分离自海南、广西及黑龙江三地的自然保护区，由海南省热带农业资源研究所保藏。结果显示：30株野生Bt菌株含有数量和大小都非常丰富的大质粒，在数量上1-6个不等，分子大小分布在45-582kb范围内不等，其中由海南吊罗山热带雨林自然保护区分离得到的菌株S3119-2和S3321-2含有大小一致的大质粒带型，都只有1条大质粒带，大小为582kb的；菌株S3161-3和S3208-3含有大小一致的大质粒带型，含有4条大质粒带，大小分别为110，180，370，460kb；菌株S3322-2和S3433-2含有大小一致的大质粒带型，含有3条大质粒带，大小分别为45，80，180kb；菌株S3012-2和S3136-1含有大小一致的大质粒带型，并且这两株菌的质粒带型还与由黑龙江凉水自然保护区分离所得的菌株S2685-1，S2809-1的大质粒带型一致，含有3条大质粒带，大小分别为70，97，200kb。与模式Bt菌株以色列亚种(Bti)相比，30株野生Bt菌株都呈现出不同的大质粒谱型，与生态地理环境相无关联。
　　 本研究利用超声波破碎法提取了供试的30株野生Bt菌株的晶体蛋白，对从人体的粪便中分离培养出的美洲钩虫(Necatoramericanus)钩蚴，进行了晶体蛋白毒力活性测定。结果显示Bt菌株S2096-2晶体蛋白对Ⅱ期杆状蚴有毒杀活性，随着晶体蛋白作用浓度和时间的增加，虫体死亡数增加。在浓度为133.25μg/ml时，48h后Ⅱ期杆状蚴的校正死亡率为30.78％，72h后校正死亡率为41.53％，96h后校正死亡率为43.52％。而30株Bt野生菌株对Ⅲ期丝状蚴均无毒杀活性。
　　 为了探索S2096-2对美洲钩虫有毒力活性的蛋白的编码基因，我们将前期已经克隆到未知杀虫活性的cry40Da1基因作为可能的候选基因，设计了引物40Da-5和40Da-3，从S2096-2中扩增出cry40Da1基因完整的编码序列。同时，设计引物pGEM-F和pGEM-R来扩增载体序列包括cry1Ac基因完整的启动子序列(pGEM)，将cry40Da1基因连接到表达载体pGEM上获得重组质粒pGEM40Da1，再经DpnI酶切验证。阳性重组子培养48h后提取蛋白经SDS-PAGE检测，未得到表达产物。这一结果与本课题组合作单位英国Sussex大学NeilCrickmore博士课题组的结果一致。将cry40Da1基因所进行的体外同源及异源表达，未能表达出目的蛋白。