Anoxybacillus sp α-淀粉酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达

摘要

α-淀粉酶(EC3.2.1.1)能够以淀粉做为底物，从淀粉内部水解1，4-α-D葡萄糖苷键，因此也被叫做1，4-α-D-葡萄糖苷水解酶，它被广泛应用于发酵、淀粉糖生产、造纸、纺织等行业，具有很大的经济价值。
　　 本实验采用稀释分离的方法从云南腾冲温泉筛选出一株可水解淀粉的嗜热细菌GXTC-3，该菌株革兰氏染色为阳性，细胞呈杆状，最适生长温度为60℃-65℃，最适生长pH为7.0-8.0。结合该菌株的生理生化特征和16SrRNA基因序列在NCBI上的比对分析，初步鉴定为Anoxybacillussp.GXTC-3。用PCR的方法，从Anoxybacillussp.GXTC-3中扩增出α-淀粉酶基因，测序验证后加入酶切位点，然后与表达载体pHIS1525连接转化大肠杆DH5α，筛选出阳性转化子DH5α-pHIS1525-JH并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌YYBml原生质体，获得基因工程菌YYBml-pHIS1525-JH。经SDS-PAGE分析表明该基因在巨大芽孢杆菌中得到了有效表达。重组酶经镍柱等纯化后，酶学性质研究表明：该酶的最适温度与pH值分别为60℃与pH8.5，在pH7.0-10.5之间具有很好的稳定性，Km值为1.94mg/mL，酶活力可达2516.5U。金属离子Cu2+、Fe3+、Hg2+、Ag+对酶活有明显的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用可使酶基本失活，Zn2+、Co2+、Fe2+、Ba2+对酶活的抑制作用则相对比较小，而Ca2+、Na+、Mg2+、K+、巯基乙醇对酶活有微弱的激活作用，一些金属离子如Li+、Mn2+则对酶活几乎不产生影响。HPLC分析表明Anoxybacillussp.GXTC-3α-淀粉酶可水解淀粉产生葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的混合物，而对α环糊精和β环糊精基本不起作用。
　　 巨大芽孢杆菌表达系统是一个较新颖的表达系统，比大肠杆菌等表达系统具有很多的优势，本实验还初步优化了巨大芽孢杆菌YYBml工程菌的培养条件，结果表明：该基因工程菌的最适碳源与氮源分别为果糖和酵母膏，在表面活性剂吐温-80存在的条件下能较高的提高外源蛋白的表达产量，在中性pH，37℃的条件下能较好的产酶。