肌肉特异性激酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

摘要

肌肉特异性激酶(muscle-specific kinase，MuSK)是一种与乙酰胆碱受体相关的跨膜蛋白，在骨骼肌的发展中，MuSK是建立突触后膜时组建主要突触骨架的首要成分。重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种由神经肌肉接头处(NMJ)突触后膜上的乙酰胆碱受体(AChR)的数量缺失和功能异常所引起的自身免疫性疾病，在AChR-Ab血清阴性MG患者中有一部分人体内检测出了含有另外一种抗体MuSK-Ab，但是MuSK-Ab在SNMG患者体内的存在情况并没有规律性，其致病机理也尚未安全明确，至今还在研究中。
　　 本实验从基因文库中获取编号为AY360453的小鼠肌肉特异性激酶基因的编码序列，在不改变氨基酸序列的前提下，将其碱基序列改为大肠杆菌M15的偏好密码子，然后合成。设计引物，分别引入BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点，PCR扩增得到1.4 kb大小的目的基因片段，将得到的目的基因构建于大肠杆菌表达载体pQE30中，获得重组表达载体pQE30-MuSK，将组质粒转入大肠杆菌JM109感受态细胞，然后通过菌落PCR、双酶切、测序等方法鉴定后，得到阳性重组菌株。将得到的重组阳性质粒转入大肠杆菌M15感受态细胞中，加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE检测是否有目的蛋白条带，MuSK酶联免疫分析试剂盒检测目的蛋白的免疫活性及其含量，测得MuSK蛋白的初始表达量为8.2 pmol/L。采用单因素优化的实验方法，分别对诱导物IPTG的浓度、诱导表达温度、诱导表达时间、培养基碳源、氮源、pH、诱导前培养温度等条件进行了优化。实验结果表明：成功的构建了pQE30-MuSK原核表达载体，MuSK蛋白在大肠杆菌M15中成功表达，且以包涵体的形式出现，MuSK蛋白相对分子质量约为48 kDa，诱导表达的最佳条件为：以终浓度为0.3 mmol/L的IPTG诱导、30℃下摇床培养12～16 h。培养基的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为大豆蛋白胨，培养基最适pH为7.0，诱导前最佳培养温度为34℃。Elisa试剂盒测得优化后的MuSK蛋白表达含量为19.74 pmol/L，较优化前的表达量有明显的提高。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略表

第一章 前言

1.1 肌肉特异性激酶的概述

1.2 肌肉特异性激酶的结构

1.3 肌肉特异性激酶与重症肌无力

1.4 影响外源基因在大肠杆菌系统中表达的因素

1.4.1 外源基因中密码子的使用

1.4.2 表达载体的选择

1.4.3 mRNA的稳定性

1.4.4 培养条件的控制

1.5 本课题研究的目的和意义

1.6 肌肉特异性激酶的国内外研究进展

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 质粒

2.1.3 主要试剂

2.1.4 仪器及设备

2.1.5 溶液和试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 菌株的培养与保存

2.2.2 MuSK基因的优化和合成

2.2.3 MuSK基因的PCR扩增

2.2.4 感受态细胞的制备

2.2.5 质粒提取

2.2.6 重组质粒的构建

2.2.7 pQE30-MuSK/E.coli M15重组工程菌的构建

2.2.8 pQE30-MuSK/E.coli M15重组工程菌的诱导表达和蛋白纯化

2.2.9 MuSK蛋白含量的检测

2.2.10 诱导表达条件的优化

2.2.11 pQE30-MuSK/E.coli M15重组工程菌培养条件的初步优化

第三章 结果与分析

3.1 肌肉特异性激酶基因的扩增和转化

3.1.1 MuSK基因的PCR扩增

3.1.2 重组质粒的构建和pQE30-MuSK/E.coli JM109阳性克隆子的鉴定

3.1.3 pQE30-MuSK/E.coli M15重组工程菌的构建和鉴定

3.2 MuSK基因在大肠杆菌中诱导表达的鉴定和纯化

3.3 MuSK蛋白的初始含量

3.4 诱导表达条件的优化

3.4.1 诱导物IPTG浓度对蛋白表达量的影响

3.4.2 诱导温度对蛋白表达量的影响

3.4.3 诱导时间对蛋白表达量的影响

3.5 pQE30-MuSK/E.coli M15重组工程菌培养条件的初步优化

3.5.1 碳源种类对蛋白表达量的影响

3.5.2 氮源种类对蛋白表达量的影响

3.5.3 培养基pH值对蛋白表达量的影响

3.5.4 培养温度对蛋白表达量的影响

第四章 讨论

4.1 MuSK重组蛋白表达结果分析及应用

4.2 外源蛋白在大肠杆菌中的表达形式

4.2.1 大肠杆菌表达系统的论述

4.2.2 外源蛋白以包涵体的形式表达

4.2.2 外源蛋白在周质间隙中的表达

4.3 蛋白的纯化

4.3.1 Ni-NTA金属鳌合层析柱纯化

4.3.2 影响蛋白纯化结果的因素

4.4 本实验的不足之处和改进想法

4.5 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文